生物技术前沿进展之二RTPCR.ppt

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1、TaqManREAL-TIMEPCR什么是RealTimePCR?实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术Technologytomonitor,inreal-time,thePCRamplificationofspecificnucleicacidtargetsRealTimePCR是如何实现的?在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence）RealTimePCR是如何实现的?随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加PCRPCRLotsofPCRPCRproductRealTimePCR是如何实现的?Real-timePCR

2、仪会纪录每个循环的荧光信号变化Cycle3FilterASample1BinNRealTimePCR是如何实现的?最后，RealTime软件会对采集到的数据进行分析RealTimePCR化学原理荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？SYBR®GreenITaqMan®TaqMan®化学原理(又称5’-Nuclease)TaqMan®化学原理TaqMan®中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物TaqMan®化学原理TaqMan®中第三段短片段序列称为探针，结合到序列中间TaqMan®化学原理探针标记两种染料分子报告染料Reporterd

3、ye淬灭染料QuencherdyeTaqMan®化学原理完整的探针报告染料Reporterdye淬灭染料QuencherdyeTaqMan®化学原理完整的探针光(激发)能量报告染料Reporter没有荧光信号TaqMan®化学原理如果探针断裂了……光(激发)TaqMan®放映开始TaqMan®化学原理Denaturatingoftemplate（模板变性）TaqMan®化学原理Annealingofoligos（引物退火）TaqMan®化学原理Taq酶登场……TaqMan®化学原理找到引物序列……TaqMan®化学原理Extensionofprim

4、ers（序列延伸）TaqMan®化学原理Extensionofprimers（序列延伸）TaqMan®化学原理Extensionofprimers（序列延伸）TaqMan®化学原理Extensionofprimers（序列延伸）TaqMan®化学原理Extensionofprimers（序列延伸）TaqMan®化学原理Extensionofprimers（序列延伸）?TaqMan®化学原理Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以“吃掉”结合到模板上的DNA片段TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针Ta

5、qMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan

6、®化学原理Taq酶开始降解探针TaqMan®化学原理Taq酶开始降解探针嗝!TaqMan®化学原理新的序列，新的信号！SYBR®GreenI化学原理SYBR®GreenI化学原理SYBR®GreenI化学原理SYBR®GreenI化学原理新的序列，新的信号！SYBR®GreenI化学原理非特异结合任意双链DNA定量结果不准确可能产生非特异性PCR产物信号SYBR®GreenI化学原理使用Meltcurve(DissociationCurve)检查PCR反应产物的特异性TemperatureFluorescence原始图谱SYBR®GreenI化

7、学原理使用Meltcurve(DissociationCurve)检查PCR反应产物的特异性TemperatureFluorescence导数图谱RealTimePCR化学原理每个循环之后理论上，反应管里的目标片断数会加倍。荧光信号相应成比例增长。RealTimePCR化学原理TaqMan®,还是...SYBR®GreenI?优点更高的特异性不会有引物二聚体干扰支持多重荧光实验设计实验方法易于优化缺点价格稍贵优点价格便宜大部分基因以及少量样品均适用缺点特异性稍差必须要做Meltcurves不支持多重荧光设计实验方法通常需要优化RealTimeP

8、CR实际状态线形图谱Linear半对数图谱LogRealTimePCR常用术语Baseline基线定义背景区域:cycle