利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库-论文.pdf

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1、第32卷第2期大豆科学V01．32No．22013正4月SOYBEANSCIENCEApr．2013利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库刘清醒。，郭长虹，毕影东，郭东林(1．哈尔滨师范大学生命科学与技术学院／黑龙江省分予细胞遗传与遗传育种重点实验室，黑龙江哈尔滨150025；2．黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨】50086)摘要：酵母单杂交体系通过筛选cDNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列，是研究DNA一蛋白质相互作用和转录因子功能的最常用、最有效的方法之一。通过构建与Gal4p的激活结

2、构域融合的表达cDNA文库，利用抗病相关基因启动子区的W．box顺式元件采用酵母单杂交方法对该文库进行了筛选，共得到4个阳性克隆。结果为进一步研究与顺式元件W-box相互作用的WRKY蛋白奠定了基础。关键词：大豆；cDNA文库；酵母单杂交中图分类号：$565．1文献标识码：A文章编号：1000-9841(2013)02-0165-03ConstructionofFusionGeneExpressioncDNALibraryofSoybeanRootwithYeastOne．hybridnethodLIUQing—xing，GUOCh

3、ang—hong‘，BIYing—dong，GUODong—lin(1．KeyI~aboratoryofMolecularCytogeneticsandGeneticBreedingofHeilongjiangProvince／CollegeofLifeScienceandTechnology，HarbinNormalUni—versity，Harbin150025，China；2．CropTillageandCultivationInstituteofHeilongjiangAcademyofAculturalSciences，H

4、arbin150086，China)Abstract：Genesequenceofproteinwhichinteractedwithspecificcis-elementcanbefoundbyscreeningcDNAlibraryinyeastone．hybridsystem．Yeastone—hybridsystemhasbecomeanimportantefficientmethodtoinvestigateDNA-proteininterac—tionandfunetionoftranscriptionfactor．In

5、thisreport，geneexpressioncDNAlibraryfusedtoactivationdomainofGal4pwasconstructed．LibrarywasinvestigatedusingW．boxcis．elementinyeastone．hybridsystem．Asaresult．4positivecloneswerefound．ThestudyDaredafoundationforscreeningWRKYproteinwhichinteractedwithW-boxcis-element．Key

6、words：Soybean；cDNAlibrary；Yeastone—hybrid酵母单杂交体系(yeastone—hybridsystem)是借列结合的蛋白质。本研究利用大豆根cDNA文鉴酵母双杂交体系的基本原理，通过观察酵母细胞库构建了融合表达cDNA文库，为进一步利用酵母内报告基因的表达状况，研究DNA-蛋白质之间的单杂交方法筛选与DNA序列特异结合的蛋白奠定相互作用。该方法已被广泛应用于寻找与目的基础。DNA片段相互作用的蛋白质分子，特别是在检测特1材料与方法定转录因子与顺式作用元件互作的敏感性和可靠性方面具有独特优势，成为

7、克隆与靶元件特异结合1．1材料的转录因子基因(cDNA)的有效方法⋯。在酵母单大豆根cDNA文库由Invitrogen公司合成，库容杂交体系中，省略了在酵母双杂交体系中采用的量5×10cfu(colonyformingunits)，平均插入片段长BD—X蛋白质杂交体，将GAIA的DNA结合结构域度1500bp，载体为pSPORT—P，具有Gateway系统置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与的attB1、attB2重组位点和氨苄青霉素(AMP)抗性目的基因相互作用就会启动下游报告基因的转录。选择标记；大肠杆菌E．coliDH

8、5(用于感受态细胞从而捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白制备)；质粒载体pPC86：酵母细胞表达载体，具有质引。该体系也适用于研究参与转录抑制和DNA色氨酸合成酶(Trp1)、AMP抗性选择标记，用于构复制过程的蛋白质J。在研究D