蓖麻毒蛋白的提取及应用研究

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1、化学与硅物互程2013，VoI．30No．12开发应用田Chemistry&Bioengineeringdoi：10．3969／j．issn．1672—5425．2013．12．015蓖麻毒蛋白的提取及应用研究I、熊冬梅。苏小军，熊兴耀。(1．湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南长沙410128；2．中国农科院蔬菜花卉研究所，北京100081)摘要：蓖麻毒蛋白是具有强烈细胞毒性的天然毒素之一，其毒性作用在生物农药、医学抗癌、细胞内转运机理研究、生物防恐等方面得到广泛的应用。简述了蓖麻毒蛋白的性质、结构及作用机理，并对蓖麻毒蛋白不同提取方法进行了比较，对其应用

2、研究进行了介绍。关键词：蓖麻毒蛋白；毒性机理；提取；应用中图分类号：R284．2文献标识码：A文章编号：1672—5425(2013)12—0059—04蓖麻毒蛋白来源于大戟科植物蓖麻，在蓖麻籽中至高尔基体后逆向转运到粗面内质网(ER)，在ER内的含量为1～5[1]。蓖麻毒蛋白由两条肽链组成，被蛋白质二硫键异构酶解离，游离出有催化活性的属于二型核糖体失活蛋白，具有天然植物毒素典型的RTA，RTA再通过ERAD(ER—Associatedprotein半毒素结构及强烈的细胞毒性，从而造就了蓖麻毒蛋degradation)途径进入胞浆催化核糖体28SrRNA脱白的双面性，一方面赋予

3、它在医学抗癌、生物农药、细去腺嘌呤，从而抑制细胞蛋白质的合成，最终导致细胞胞内转运机理研究等方面的潜在作用和优势；另一方死亡引。面因难以察觉且快速致命的强烈毒性使其成为恐怖袭2蓖麻毒蛋白的提取方法击者的武器，威胁人类生命安全。随着蓖麻毒蛋白在医学、农业、军事防控等领域应用的拓展，研究者们对不同提取方法获取的蓖麻毒蛋白在纯度、质量、结高纯度、高活性的蓖麻毒蛋白的需求进一步增多，因此构等方面不同，因此提取方法直接影响着蓖麻毒蛋白获得高效提取蓖麻毒蛋白的方法具有重要意义。的研究方向和用途。2．1物理化学法1蓖麻毒蛋白的性质、结构及作用机理物理化学法提取蓖麻毒蛋白的主要步骤是物理研蓖麻

4、毒蛋白为无味白色粉末或结晶型固体，不溶磨、盐析、透析获取粗蛋白，然后利用亲和层析法进行于有机溶剂，易溶于稀酸或盐类水溶液，能在饱和硫酸蛋白的分离纯化。代表性的物理化学提取法是Nicol—铵溶液中沉淀析出，对热、酸、碱比较稳定，干热处理不son和Blaustein的方法L4]，即磷酸缓冲溶液法粗提和易变性引。琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化蓖麻毒蛋白。蓖麻毒蛋白是由效应链RTA和结合链RTB经2．1．1蓖麻粗毒蛋白的制备二硫键结合而成的异源二聚体植物蛋白毒素，RTA由目前蓖麻粗毒蛋白的制备主要有磷酸缓冲溶液提263个氨基酸残基组成，分子量32000；RTB由259个取法和稀酸提取法。

5、一般的步骤为：取一定量脱壳蓖氨基酸残基组成，分子量34000。麻籽匀浆后用磷酸缓冲溶液或稀酸于4℃浸泡16h；蓖麻毒蛋白的作用机理是由RTB利用乳糖结合四层纱布过滤，取上清液离心2Orain，弃沉淀及上层位点与细胞表面糖脂或糖蛋白受体结合，通过细胞吞脂肪；获得的液体用6O饱和硫酸铵溶液于4℃浸泡噬作用将RTA携带进入细胞内，毒蛋白分子被转运过夜，离心20min；取沉淀用磷酸缓冲溶液或稀酸进基金项目：国家科技支撑计划项目(2011BAD22B04)收稿日期：2013-09—24作者简介：熊冬梅(1986一)．女，贵州都匀人，硕士研究生．研究方向：生物质能源，E—mail：xiat

6、ian4545@163．corn；通讯作者：苏小军，副研究员，E-mail：suxiaojun5606@163．CON。熊冬梅等：蓖麻毒蛋白的提取及应用研究／2013年鞭12期行透析，透析完成后用PEG6000覆盖脱水或真空冷冻Tris—HC1缓冲溶液洗脱得到RTB粗品。将粗品上样干燥透析液，最终获得蓖麻粗毒蛋白。蓖麻粗毒蛋白DEAE52柱一步纯化，由于RTA的等电点为7．6、的杂质越少，越利于后期的分离纯化。RTB的等电点为5．5，用pH值为8．5的含5巯基乙为提高粗毒蛋白提取率，研究者对蓖麻粗毒蛋白醇的0．1mol·L-1的Tris—HC1缓冲溶液洗脱得到制备方法做了改进。

7、陈祥胜等[5认为蓖麻籽匀浆中的RTA纯品，用pH值为8．5的含0．15tool·L-1NaC1脂肪对蛋白有较强阻隔作用，易导致蛋白不能充分提及5％巯基乙醇的0．1tool·L的Tris—HC1缓冲溶取，因此在提取前将蓖麻籽的匀浆进行脱脂，有效地提液洗脱得到RTB纯品[10,11]。高了蛋白质的提取率，并发现磷酸缓冲溶液处理的粗2．2生物制备法毒蛋白产率明显高于稀酸提取法。王莹等[6]对蓖麻毒生物制备法主要是通过基因载体向适合的受体细蛋白提取过程进行了优化，用匀浆冰浴研磨及高速冷胞导人目的基因