分析方法的开发.doc

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1、分析方法的开发分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。1.色谱柱的选择原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的

2、分析时间，极大的提高工作效率。一般选用直径为4.6mm或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。三种类型包括：1)普通的C18或相应的C8色谱柱，如Waters的SymmetryC18或C8，YMC的PackProC18或C8，Agilent的RXC8等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如

3、Waters的SymmetryShieldRP18或RP8，XTerraRP18或RP8，YMC的ODSAQ，Agilent的ZorbaxSBAQ等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上也会有差异，这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个很好的选择。相同品牌型号的色谱柱，C18和C8在选择性上没有差异，但是C18保留能力更

4、强，相同的样品分离度更高，我们一般倾向于选择用C18。我们在筛选色谱柱时尽量选择行业内排名前几位的厂家，柱子品质好，开发分析方法时能省很多力气，做出来的分析方法也有保证。一个药从开发到上市可能会持续十几年甚至更长时间，厂家有实力，开发方法时选定的柱子在若干年以后需要时还会有的买，做分析时重复性也能保障。多用几只色谱柱做筛选和分析方法优化，能尽最大的可能提高分析方法的质量，保证检测结果的可信度。我比较喜欢用的柱子有：Agilent的ZorbaxEclipseXDB-C18、ZorbaxEclipsePlusC18，Waters的Symmetry

5、C18、XTerraRP18、XTerraMSC18等，YMC的柱子有时会是不错的备用选择，菲罗门的柱子菲罗门的柱子国内外市场占有率较高，但是感觉柱子压力高，寿命短，尽量不用，热电的柱子用的也不少，但没什么感觉。制剂分析方法选择色谱柱的要求基本和API相一样，对于中间体和生产过程中反应跟踪（IPC）分析方法开发使用的色谱柱，一般会根据样品性质直接选取一两只普通C18或者封端处理过的色谱柱，简化筛选过程。2.流动相的选择常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收

6、，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三

7、氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。1)流动相pH值改变可以改变样品的保留时间和分离度；2)流动相pH值改变甚至可以改变某些样品出峰的先后顺序；3)流动相pH值改变可以改变样品的峰高，即可以调整峰形。相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好，看出多数样品

8、在低pH值下峰形都比中性要好，这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖