细胞转染的步骤.docx

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1、【试剂与仪器】1．小牛血清。2．双抗溶液（链霉素100μg+青霉素100单位）。3．DMEM培养基。4．转染试剂（LIPOFECTAMINE2000）。5．细胞培养基（DMEM+10%NCS）。6．PBS。7．无血清培养基。8．胰酶（Trypsin）。9．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD。【操作步骤】1．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。2.对于每孔细胞，使用50μl无血清DMEM培养基稀释0.8μg-1.0μgDNA。多孔操作可以批量

2、制备。3.对于每孔细胞，使用50μlDMEM培养基稀释1μl-3μlLIPOFECTAMINE2000试剂。LIPOFECTAMINE2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。4.混合稀释的DNA（由第2步）和稀释的LIPOFECTAMINE2000（由第3步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。5.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。6.在37℃，5％的CO2

3、中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。7.在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。