细胞代谢产物提取物中分解产物的鉴定.doc

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1、细胞代谢产物提取物中分解产物的鉴定摘要：分析细胞代谢产物的方法大多数都需要从细胞中提取代谢产物。这些方法关注的是由于提取不完整造成对代谢水平的估计不足。然而，通过这些提取方法的比较，似乎提取一个特定的代谢产物最好的方法是使产量达到最大。在以不同浓度甲醇水溶液提取大肠杆菌的实验中：通过液相色谱-串联质谱法对提取结果进行分析，我们观察到使用含水量≥50%的溶液进行提取得到的核苷和碱基的产量比使用含水量≤20%的溶液进行提取要高。然而，在提取物中添加标记了同位素的核苷进行示踪显示，核苷和碱基的高产量是由于核苷和核苷酸在水分充足条件下分解导致的，而不是因为采用了良好的提取方法。同位素示踪标记

2、法是检测细胞代谢物提取物中分解产物普遍采用的一个方法。甲醇水溶液提取大肠杆菌实验中，低温和高浓度的甲醇最大限度的降低了代谢物的分解。关键词：代谢组学；新陈代谢；提取；细菌；取样；稳定性；液相色谱-质谱/质谱法；三重四极杆；小分子细胞代谢网络在生物学，将吸收的营养物质转化成能源，生物大分子亚基和信号分子中起着基础性作用。由于这些过程的重要性，人们对尽可能完整的理解细胞代谢活动有很大的兴趣。为此，在过去5年研究中，在并行文献中看到试图对细胞代谢网络的许多组成成分的研究显著加快，普遍关注的是通过改变营养状况造成细胞环境的扰动而导致代谢产物浓度的定量变化。代谢产物分析遇到的一个长期挑战是从生

3、物样品中提取感兴趣的化合物。尽管避免了需要通过直接在居住环境范围内对感兴趣的分析物进行提取来衡量，这种可能性是很吸引人的（例如，采用核磁共振[NMR])，绝大多数的代谢产物分析仍继续通过提取完成。提取物的使用在样品的浓缩和分离中具有重要优势。此外，使用质谱（MS）有利于分析，质谱对于从复杂的混合物中鉴定和定量低含量的组成成分来说是一项独特的强大技术。在努力使基于细胞的代谢更加定量和系统的一部分研究中，已经有越来越多的研究来确定适合广泛的代谢产物谱的提取条件，同时也了解这些提取过程的局限性。例如，Maharjan和Ferenci采用薄层色谱法分析放射性标记的样本，研究了分别以沸乙醇水溶

4、液，冷甲醇水溶液和热甲醇水溶液，冷高氯酸溶液和冷氢氧化钾水溶液提取大肠杆菌的效率。根据其得到最高数量代谢产物的提取方法的产量最高，同时也能够避免高温或极端PH的直接影响，他们发现冷甲醇水溶液法（他们以50:50混合进行实验）是最好的方法。随后，Villas-Boas和他的同事在酿酒酵母中进行了相关实验。相对于侧重细胞原料的提取，取而代之的是他们使用气相色谱—质谱法作为检测方式测量了加入示踪同位素标记的代谢产物的复原，发现冷的纯甲醇法使代谢产物损失降到最低，这是Maharjan和Ferenci没有探索出的条件。基于这些结果以及我们自己的研究，我们首先使用冷的80:20甲醇水溶液提取细菌

5、沙门氏菌，平行提取三次以提高代谢产物总产量。在三次提取结束后，随后使用其他的混合溶剂进行提取，大部分代谢产物没有大量产生，通过这我们有理由证明此过程的有效性。虽然之前的这些研究在确定适合以细胞为基础的代谢组学的提取方法方面取得了很大进展，但是他们没有回答如何判断一个提取方法这一根本问题。获得尽可能多的可测定数量的内源性代谢物是重要的特点？它能使具体的关键代谢产物产量最大化？它能最大限度的减少标准代谢产物的损失？没有额外的代谢产物，提取能得到更高的提取产量？为进一步优化内源性代谢产物的提取，我们在不同条件下提取大肠杆菌，与一些最初探索使用冷甲醇水溶液提取条件不同的是，我们使用的水分含量

6、不同。我们惊奇的发现，甲醇含量从80%至50%明显的改变了代谢物结构，在使用80%甲醇溶液提取的结果中核苷酸含量丰富，同时核苷和碱基在50%甲醇中含量更高。这就提出了以下问题：80%和50%的甲醇水溶液哪一个是较优的提取溶剂？利用同位素示踪标记的方法，我们得出一个明确的答案：甲醇含量高的溶液是较优的提取溶剂，因为在水分含量充足条件下核苷和碱基的提取效果明显“好”，实际上是由于核苷酸的分解。这一研究结果强调了选择提取方法的重要性，正确的提取方法能由生产出的产品反映真正的细胞内环境，而不仅仅是产生大量的代谢产物。材料和方法化学药品VWR国际公司（西切斯特，宾夕法尼亚州，美国）生产的HPL

7、C级溶剂（全溶剂，易安迪化学试剂，吉布斯顿，新泽西州，美国），万灵科化学品公司（菲利普斯堡，新泽西州，美国）生产的乙酸铵（纯度99.4%）和飞世尔科技（匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）生产的氢氧化铵（纯度29.73%）。所有的纯代谢物标准品和媒介组分都来自西格玛-奥德里奇公司（圣路易斯，密苏里，美国），而且从制造商得知它们的纯度都≥98%。剑桥同位素实验室（安多弗，马萨诸塞，美国）提供的U-13C标记的葡萄糖（纯度99%）。细胞生长和提取所有试验中均使用大肠杆