扁蓿豆冷诱导基因转录差异cDNA—AFLP反应体系的构建-论文.pdf

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1、第35卷第2期中国草地学报2013年3月Vo1．35No．2ChineseJournalofGrasslandMar．2O13文章编号：1673—5021(2013)02—0013—06扁蓿豆冷诱导基因转录差异eDNA—AFLP反应体系的构建张宇，石凤翎，高霞，蔡丽艳。(1．内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古呼和浩特010019；2．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特010010)摘要：以O~C低温处理3～5叶期扁蓿豆的幼苗嫩叶为试验材料，对影响其cDNA—AFLP反应体系的各个关键因子进行探讨和优化

2、，建立适宜的扁蓿豆cDNA_AFLP扩增体系，并对扁蓿豆冷诱导的差异表达进行检测。结果表明，利用MseI／EcoR1分步酶切连接，以4ul稀释2O倍的预扩产物作为模板、1．6uldNTP、0．4~lTaqDNA酶、2ullO×PCRBuffer获得的选择性扩增效果较好，条带清晰稳定。应用该反应体系扩增出的扁蓿豆冷诱导差异片段有五种表达类型，为扁蓿豆抗寒基因转录水平差异表达的研究奠定了基础。关键词：扁蓿豆；冷诱导；cDNA—AFLP；差异表达中图分类号：$541文献标识码：A扁蓿豆(Medicagoruthe

3、nica)是豆科苜蓿属多1材料和方法年生植物，其营养价值较高，在抗寒、抗旱、耐盐碱方面表现突出，因此备受牧草育种者的关注。国内外1．1材料与试剂研究者对内蒙古不同生态地区扁蓿豆材料的研究认直立型扁蓿豆3～5叶期幼苗(CK)，在0℃条为，扁蓿豆是改良紫花苜蓿抗逆基因的优质资件下分别处理12h和36h，取其嫩叶置液氮中速冻，源[1]。直立型扁蓿豆[Medicagoruthenica(L．)一8O℃保存。ev．Zhili]是从野生扁蓿豆中选育出的高产、高抗的EcoRI和Mse工购自NewEnglandBillab

4、s牧草新品种，可种植于苜蓿不能越冬的干旱、寒冷地(NEB)公司；T4DNA连接酶、TaqDNAPolymer—区_4]。目前，对扁蓿豆的研究报道主要集中在生ase、dNTPs、10×PCRBuffer购白天根生化科技有物学、细胞学、生态学等方面]，关于扁蓿豆抗逆限公司；接头和引物由上海生物工程有限公司合成，相关分子水平方面的研究尚未见到报道。其余试剂均为国产分析纯。cDNA-AFLP(cDNA-amplifiedfragmentlength1．2方法，polymorphism)技术是Bachem[9等在AF

5、LP基础上1．2．1RNA的提取及cDNA的合成结合RT—PCR优点发明的新型RNA指纹分析技利用天根公司的植物总RNA试剂盒提取试验术，因其保留了AFLP和mRNA技术许多优点，被材料嫩叶的总RNA，采用大连宝生物(Takara)公司广泛应用在作物、花卉、树木的发育、逆境胁迫反的M—MLVRTasecDNASynthesisKit试剂盒合应及生理调控等方面。cDNA—AFLP技术逐渐成成双链cDNA。为研究基因表达模式的有效工具，也是研究转录1．2．2cDNA的酶切和接头连接基因组的新方法和新手段。近几年

6、，通过cDNA—利用NEB公司的EcoR工和Mse工两种限制性AFLP技术对苜蓿的雄性不育、雌性不育、根瘤菌、内切酶对cDNA进行双酶切，酶切总体系201,1包衰老等方面进行研究，并了解了相关基因的调控括：模板cDNA5．0>1，EcoRI(10U／u1)1／,1，Mse工模式_】¨]。随着蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(10U／u1)1ul，100×BSA0．2ul，EcoR工Buffer2．0基因组全序列测定的完成，对豆科植物功能基因组学的研究也逐渐深入。本研究以低温胁迫处理通讯作者，

7、E—mail：s{10000@126．com．的直立型扁蓿豆幼苗为材料，采用EcoRI和Mse收稿日期：2012-07—23；修回日期：2012一l1—20基金项目：内蒙古应用技术研究与开发资金项目——退化及受I为限制性内切酶，分析研究影响扁蓿豆cDNA—损生态系统治理恢复与资源综合利用技术研究“抗逆优良乡土草种AFLP反应体系的重要因子，建立适合扁蓿豆的的选育研究”课题；内蒙古农村领域科技计划项目(20091401)cDNA—AFLP反应体系，为分离和克隆扁蓿豆抗逆作者简介：张宇(1983一)，女，内蒙古

8、四子王旗人，在读博士生，基因奠定基础，也为其他牧草抗性育种提供基因主要研究方向为牧草遗传育种，E—mail：ll09zhangyu@163．com．资源。张宇石凤翎高霞蔡丽艳扁蓿豆冷诱导基因转录差异eDNA—AFLP反应体系的构建例的最佳酶切组合也不同，如李飞等通过计算机模toidesruthenicus(L．)cv．Zhiliinalpine—coldmeadow[J]．Chi—neseQinghaiJourn