病毒性肝炎标志物检测(沈云松).pdf

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1、病毒性肝炎标志物检测的质量保证沈云松几个概念�质量保证�室内质量控制�室间质量评价�准确度�偏差�精密度室内质量控制�一、测定前的质量控制：实验室的环境、设施和设备�二、理想的测定试剂和方法�三、人员培训统计学质量控制�一、室内质控样本的选择：基质效应，浓度水平，稳定，无已知传染危险性，靶值已定，容易获得，价格可以接受。�二、质控物浓度的选择：3SD＞1也即2-4倍cutoff值浓度作为室内质控管理体系，另选择S/CO=1.5左右作为测定下限。确立靶值、控制线�一、OCV�二、RCV失控分析�系统误差：22s，41

2、s，10X仪器、试剂�随机误差：12s，13s，R4s操作中EQA操作客观及时回报符合要求清楚明白ELISA测定操作中的注意事项�一、临床标本的收集和处理�二、试剂准备�三、加血清样本及反应试剂�四、温育�五、洗板�六、显色ELISA测定操作中的注意事项�七、读取吸光度�八、结果判定�九、结果报告及解释乙肝标志物临床常见模式序号S抗e抗抗c出现率说明Se%1+—+—+30+急肝，慢性活动期，有传染性2+——++10+-慢性携带者，弱传染性3———++10-恢复期，弱传染性4+———+10+-急肝或慢性HBsAg携带

3、者5————+10-急性窗口期或既往感染过6—+—++5-康复期7—+——+10+既往感染过，仍有免疫力8—+———5+-康复期，主动、被动免疫后9—————10+-未感染过HBV常见造成假阳性假阴性的原因一、造成假阴性的原因1.产试剂的厂家资金不足，设备落后，尤为在人工包被的情况下，生物活性材料不同于普通试剂。发生“漏包”现象或包被的抗原（抗体）活性不足或失活。2.漏加样品或加样量不足，（尤为在阈值左右的）。ELISA法只用微量样品，少加或多加1μl样品就会导致处于临界值的标本忽阴忽阳，因此加样技术是关键。3.漏

4、加酶标二抗、底物显色剂或作用时间不够，作用温度不够等均可导致假阴性。4.试剂质量不佳，保存不当，超失效期了，运输不当（温度、湿度、运期）蒸馏水质不纯。尤为在不设阳、阴性对照的情况下，极易报出假阴性。5.大批量样本的检测情况下，先加显色剂的孔呈色较早，由于工作量大，观察结果时超过了时间，或由于工作疏乎错过观察时间，这样对于易褪色的反应造成假阴性，反之致假阳性。6.样品加NaN防腐抑制了酶活力237.目前多数厂家所提供的阳性对照为使阴、阳性分明，采用高浓度、强阳性。这是造成假阴性的主要原因。因此了解流行病学是重要的。重

5、复性好、灵敏度低的倾向应引起关注。有的试剂盒可漏掉5%的阳性率。故建议：检测HBsAg时，2IU/ml、1IU/ml的临界值血清是必须要做的。这是目视法不准的主要所在，所以必须使用酶标仪来判读结果。8.洗涤冲击力过大，洗涤液浸泡时间过久或洗涤次数过多，可以导致假阴性，因此洗板机的配套是必要的。二、造成假阳性的原因：1.吸附作用：自身免疫病（SLE、类风湿）患者的血清中某些特殊组分，例如：IgG抗体，属抗抗体，也会对包被板轻微吸附，因聚苯乙烯板对蛋白质吸附是非特异的，致一些阴性标本显色。以HCV抗体检测为例：包被基因

6、工程抗原和合成肽成分，基因工程抗原多为融合蛋白。个别标本中的IgG对融合蛋白轻微吸附，经反应而呈色。因此间接ELISA法通过提高阈值的方法来排除非特异性反应。国内外丙肝试剂盒的阈值一般在0.20~0.45之间。Abbott公司定在0.32。事实上显色值在0.15±时，目视到可见颜色了。即：间接ELISA法，由于方法学本身的限制（不如双特异性的双抗夹心法）不可避免地会出现阴性标本的显色情况。不能一显色就判为阳性，否则就叫假阳性。内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。

7、常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig（s）抗体、交叉反应物质和其它物质等。1)类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的扑获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：（1）用F（ab）2替代完整的IgG；（2）标本用联有热变性（63℃，10min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效）；（3）检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。2)补体ELISA系统

8、中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：（1）用EDTA稀释标本；（2）用53℃，10min加热血清使C1q灭活。3)嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig（s）结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性