精子与睾丸组织的冷冻与复苏_邢柳.pdf

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1、实用妇产科杂志2016年4月第32卷第4期JournalofPracticalObstetricsandGynecology2016Apr．Vol.32，No.4·245·文章编号:1003－6946(2016)04－0245－03快速冷冻损伤，又不会产生慢速冷冻损伤的降温速度，同时，借助冷冻保护剂的作用，采用适合的冷冻方精子与睾丸组织的冷冻与复苏法，能最大程度的获得细胞复苏率。11，21，21.2冷冻保护剂冷冻保护剂的作用主要是减少冰邢柳，朱文兵，范立青晶的形成，保护细胞顺利地通过临界温度阶段。选择(1．中信湘雅生殖与遗传专科医院，湖南长沙410078;2．中

2、南大学生殖与干细胞工程研究所，湖南长沙410078)冷冻保护剂时需具备两条基本原则:①它们对冷冻的细胞无毒性;②须具有高度水溶性，保证在冰晶形成中图分类号:Ｒ714.8文献标志码:B过程中，冷冻保护剂的浓度增加时仍然留在溶液中不被析出。冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种。精子与睾丸组织的冷冻与复苏是目前男性生育渗透性保护剂多为小分子物质，能够自由通过精子细力保护的主要方法，男性进入青春期后，睾丸生精上胞膜，可以在冷冻时渗入细胞内平衡精子内外渗透皮中精原干细胞即开始精子发生的过程，经过约64压，减少冰晶形成。常见的渗透性保护剂有甘油、乙天的发育，完成减数分裂并最终

3、形成精子。在我国，二醇、二甲基亚砜等。非渗透性保护剂则主要是一些一般13岁以后的青少年男性精液中即可见到精子，大分子物质，不能自由通过细胞膜，冷冻时细胞皱缩，此时，如需要进行生育力保存，可采集新鲜精液进行细胞内水分外溢，从而减少细胞内冰晶的形成。此类冷冻。而对于青春期前的男孩，如恶性肿瘤患者放化保护剂对快速和慢速冷冻同样有效。常见的非渗透疗之前，则需冷冻睾丸组织来进行生育力保护。性保护剂有卵黄、人血清白蛋白、蔗糖、氨基乙酸、乳1精子的冷冻糖等。20世纪60到70年代，人类精子库技术逐渐成目前，男性生育力保护的首选和唯一临床常规应熟，对于精子保护剂的研究大量涌现，

4、比较常见的是用的方式是采用人类精子冷冻保存技术，该技术将精甘油-卵黄-枸橼酸钠复合剂，主要由甘油、纯净水、蔗子冷冻储存在超低温环境中，具有稳定、高效，无创糖、卵黄、甘氨酸、柠檬酸三钠二水等成分组成。配置伤、复苏率高等特点。好冷冻保护剂后还需置于56℃水浴中约30分钟进行1.1冷冻的基本原理在一定的低温条件下，以足补体热灭活。并且还要将保护剂进行细菌培养、精子够的时间作用于细胞，使得细胞的降温、凝固、非损伤毒性试验等检测，检测无异常后方可放入－70℃低温性结冰或玻璃化转变，让细胞代谢降低进入休眠状冰箱保存，保存期一般不超过3个月。出于对卵黄生态，从而达到长期储存细

5、胞的目的。精子不同于身体物安全性的考虑，研究者不断寻求可以替代卵黄的优质其他细胞，仅含有少量的细胞质与水分，相对来说，在保护剂原料，如人血清白蛋白等。近年来，商品化冷冻冷冻过程中，细胞能发生足够的脱水和皱缩，在极低保护剂更新面世，亦能得到良好的冷冻复苏率。的温度下不形成过多的细胞内冰晶。精子冷冻储存1.3冷冻方法目前，冷冻管储存法是我国人类精的基本原理是利用冷冻保护剂和冷冻过程中细胞外子库使用最为普及的精液保存方法，将精液与保护剂冰晶的作用，形成细胞内外的渗透压梯度使细胞皱按照一定比例混匀后，分装至冷冻管内，并进行标记。缩，减少损伤细胞的细胞内冰晶形成，并最终在

6、深低精子的冷冻方法较多，主要有:液氮熏蒸法、快速冷冻温下，在细胞内形成玻璃化状态。在精子冷冻过程法、三阶段冷冻法(程序冷冻法)、微量精子冷冻法等。中，随着温度的不断下降，细胞外液中的水份先形成①液氮熏蒸法:将装有精液与保护剂的冷冻管放至液细小的颗粒状冰晶，导致细胞外液减少，造成脱水状氮水平面一定高度，持续一定时间，最后投入液氮中储态，电解质浓度增加，细胞外液渗透压升高，细胞内外存。②快速冷冻法:先将装有精液与保护剂的冷冻管放渗透压失衡，水份从细胞内向细胞外流动，引起细胞至冰箱冷冻室－20℃中，再放入－80℃冰箱中放置一段自身脱水皱缩。冰晶在细胞外形成还是在细胞内

7、外时间，最后投入到液氮中。③三阶段冷冻法(程序冷冻同时形成主要取决于冷冻降温速度。降温过快，细胞法):利用程序冷冻仪，将标本以不同的速度通过3个不外液渗透压忽然升高，细胞内液来不及脱水，因而在同的温度阶段(20℃～－5℃，1.5℃/min;－5℃～细胞内形成冰晶，细胞内冰晶的机械损伤可破坏细胞－80℃，6℃/min;－80℃～－196℃，30℃/min)进行内超微结构，造成细胞死亡，这一现象称为“快速冷冻降温冷冻，温控更准确，可以大批量冷冻精子，是目前损伤”。相反，在慢速冷冻时，细胞外液中冰晶大量形人类精子库最常采用的冷冻方法。④微量精子冷冻成，而又未达到储存温

8、度，细胞发生了严重的脱水