探讨如何运用模式生物研究SCNA的功能（ X页）.doc

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1、探讨如何运用模式生物研究SCN5A的功能第一章，背景知识利用模式生物来研究生物学问题是指利用生物进化的保守性，从一•种实验生物得到的有关基因性质或功能方而的信息运用于其他生物。往往利用一些技术上更容易操作的生物来研究高等生物的生物学问题。在分类学上，小鼠属于哺乳纲，由小家鼠演变而来。它广泛分布于世界各地,经长期人工饲养选择培育，已育成1（X）0多近交系和独立的远交群。1.成熟早，繁殖力强。小鼠6〜7周龄时性成熟，雌性35〜50口龄，妊娠期为19〜21天；哺乳期为20〜22天;一次排卵10〜23个（视品种而定）,每胎产仔数为8〜15头，一•年产仔胎

2、数6〜10胎，属全年、多发情性动物，繁殖率很高，生育期为一年。2.对外来刺激极为敏感。对于多种毒索和病原体具有易感性，反应极为灵每攵，如百万分之一的破伤风毒素能使小鼠死亡,这是其他实验动物所不能比拟的。对致癌物质也很敏感，自发性肿瘤多。3.便于提供同胎和不同品系动物。可根据实验要求选择不同品系或同胎小鼠做实验，也可选择同一品种（或品系）、同年龄、同体重、同性别的小鼠做实验，由于动物遗传均一，个体差异小，实验结果精确可靠。经长期人工饲养选择培育，已育成多达千余个独立的远交群和近交系。由于小鼠繁殖快，饲养管理费用低,所以成为生物医学研究小广泛使用的模

3、式生物,也是当今世界上研究最详尽的哺乳类实验动物。小鼠胚胎干细胞的分离和基因敲除技术的应用，更为以小鼠为对象的发育生物学研究起了推波助澜的作用。2002年8月公布了老鼠基因组物理图谱的框架。随后完整的老鼠基因组图谱也完成。SCN5A基因简介SCN5A基因是位于3号染色体p21-23处，编码心脏钠通道a亚单位Nav1.5的亚单位的基因。在窦房结JL有很多跨膜电流参与心脏起搏活动的形成。Navi.5通道在窦房结电生理活动屮发挥着重要的作用，心肌细胞上主要的钠通道是NaV1.5,功能增强或者功能减弱均可导致快速/缓慢型心律失常的发生。在窦房结上，阻断钠

4、通道可以导致起搏活动的减弱以及延缓窦房结动作电位的传导。研究还发现,SCN5A基因的突变可以导致Nav1.5通道蛋白表达运输的障碍,以致细胞膜上通道蛋白数量减少。细胞膜JL钠通道数量，对保障细胞的快速去极化至关重要。数量的降低，会严重降低去极化的速率，导致0期去极化的幅度减低，传导速度降低。自从1995年以来，编码Ncivl.5的SCN5A屮有至少170个自然发生的突变可以引起心脏疾患，包括诸如先天性的和获得性的长QT间期综合征，Brugada综合征，传导紊乱以及婴儿猝死综合征，病态窦房结综合征和心房颤动以及扩张型心肌病。这一系列的研究说明Njv

5、1.5通道对心肌细胞动作电位的产生和传导以及其它生理功能发挥着重要的作用。因此通过对SCN5A基因的缺失，就可能导致N“vl・5通道功能的改变，模拟出人类相应的疾病。ScnSa基因敲除小鼠模型的建立及鉴定遗传病是由丁遗传物质发生改变造成的，如基因突变或者染色体畸变等。基因打靶技术是能够修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传的技术。通过基因打靶途径建立的基因缺陷型的遗传小鼠模型(基因敲除小鼠)，是研究疾病的发生机制，分子基础及诊断的主要动物模型。Papadatos等利用转基因技术开发thScn5a基因部分敲除小鼠。纯合子小鼠心室腔

6、严重的发育性缺陷，从而导致胚胎死亡；而杂合子(Scn5a+/-)小鼠N“vl.5通道电流减小，可以表现为室性心动过速等心律失常。Scn5a+/■小鼠心肌细胞的Navl.5通道电流较野生鼠明显减小，而通道的激活和失活没有改变，提示存在着Nnvl.5通道表达运输的障碍，同时也观察到Scn5a+/-小鼠可以出现缓慢型的心律失常。因此，Scn5a+/-小鼠也为研究钠通道电流减弱所致的窦房结功能障碍提供了可能的动物模型。在该研究屮通过对Scn5a+/■小鼠窦房结细胞Navl.5通道电流和表达，以及窦房结等传导组织电生理特性的研究，阐明Scn5a基因缺失导致

7、窦房结功能障碍的机制。基因敲除小鼠的基本程序获得FI的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体屮，从重组质粒屮切除H的基因的大部分同源DNA序列，只保留部分序列在线性载体屮，将带有GFP-neo基因和HSK-tk基因克隆到此线性载体屮构成打靶载体。通过显微注射法将打靶载体导入ES细胞，以载体上的GFP-neo基因置换ES细胞基因上的FI的基因，从而得到丧失了FI的基因的ES细胞。基因敲除ES细胞注射入胚泡将基因敲除的ES细胞注射入胚泡屮，使其与源胚泡丛的细胞共同组成胚泡的内细胞团。胚泡植入假孕小鼠的子宫中将含有基因敲除ES细胞的胚泡移植

8、到假孕小鼠的子宫腔内，使ES细胞有机会发育成为小鼠或某种组织。这种胚泡屮既含有基因敲除ES细胞，又含有胚泡原有的正常ES细胞，因此，这种