慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc

《慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X™LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P11）;Lenti-X™shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X™LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X™shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)）或DNA中

2、量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X™LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X™shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine™LTX&PlusReagent(Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a.转染前24小时，把4–5x106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b.29

3、3T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c.用之前充分混匀PLUSReagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNAPlasmidDNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUSReagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube1，温和混匀，室温孵育5分钟；d.充分混匀MixLipofectamineLTX，在EP管中加入45ul的MixLipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube2，温和混匀；e.将Tube1的溶液

4、加到Tube2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube1(PlasmidDNA)Tube2(LTX)15ugDNAMIX(pLVX-shRNAPlasmidDNA455µlOpti-MEM：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15µlPLUSReagent45µlMixLipofectamineLTXUpto500µlOpti-MEM500µlTotalVolume500µlTotalVolumef.将1ml转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。g.将细胞放入置于37℃、5%CO2培养箱中培养，12

5、小时后换上新鲜的培养基继续培养。h.转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45μm低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；方法三：C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf（目前唯一使用方法）1.病毒上清收集转染后12h,48h,72h分别收集一次；一、纯化方法一：(i)病毒上清（接一、包装4.病毒收集）.(ii)Add51mlofa50%PEG6000solution.(iii)Add21.7mlofa4MNaClstocksolution.(iv)Add23.3mlofPBS.Thiswillresultinafinalv

6、olumeof300ml.ThefinalPEG6000concentrationwillbe8.5%andthefinalNaClconcentrationwillbeB0.3M.(v)Distributethesampleas150-mlaliquotsintwo250-mlpolypropylenewide-mouthedbottles.(vi)Storethebottlesat41Cfor1.5h.Mixcontentsevery20–30min.(vii)Centrifugebottlesat7,000gfor10minat41Cusinga

7、Beckmanfixed-angelJLA-10.500rotor.(viii)Aftercentrifugation,awhitepelletshouldbevisible.(ix)Carefullydecantthesupernatantandadd1.2mlof50mMTris-HCl,pH7.4,perbottle.Resuspendthepelletsbyvigorouslypipettingliquidupanddown.(x)Vortexthebottlesvigorouslyfor20–30stofurtherresuspendthep

8、ellets.(xi)Transferthevectorsuspensionintoscrew