慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

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1、一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1.随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。2.在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。3.倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。4.加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。5.镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。6.细胞计数。7.将细胞离心，1000rpm，2min。8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。10.第二天将细胞放入液氮灌，并

2、记录。二、293T细胞的传代1.当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。2.消化细胞，方法同上。3.细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。4.分到10cm培养皿中，10ml/皿。三、293T细胞的复苏1.当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。2.打开水浴锅，设置温度为40℃。3.查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2min内使细胞溶液完全溶解。4.将

3、1ml细胞溶液加入9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。6.第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(forwardprimer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(reverseprimer)and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'(probe)2.TaqManUniversalPCRMas

4、terMix(AppliedBiosystems，cat.no.4304437)3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems，cat.no.401970)4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems，cat.no.4316844) 用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCCNo.CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。慢病毒的包装1.预先准备3个T150瓶的

5、293T细胞，培养基为DMEM+10%FBS，1%Glutamax，1%青霉素-链霉素。2.将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。3.第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。4.转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。5.取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。另一支中加入500μlTr

6、ans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。6.室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。7.取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。8.6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。9.转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接

7、近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。10.将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。11.收集所有的上清，分装到50ml离心管中。12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。13.总的上清约为204ml，用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法1.取6个Ultra-clearSW28