新手指南-PCR一点通.pdf

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1、PCR-从实验建立到完成回收新手指南PCR窍门一点通Sample&AssayTechnologiesPCR1985年，K.Mullis和同事们发明了DNA聚合酶链式反应（PCR），这一革命性的成就推动了分子生物学和分子医药领域的进展。同时，生物标志物的发现，基因调控、癌症研究等主要研究领域的发展，又给现有的PCR技术带来的更高的要求和不断的挑战。这其中就有对更高通量、更高检测敏感度，以及可靠的数据分析的需求。而检测方法的建立与评估、数据的可重复性及得到结果所需的时间仍旧是研究者们面临的主要问题。PCR指导原则PCR扩增实验已经成为常规实验，

2、关于PCR操作的试验方案也数不胜数，可是科学研究者们仍然会在PCR实验中遇到技术困难，并经常得不到特异性的扩增产物。虽然PCR过程中出现的常见问题很多，如弥散的产物、低产量、非特异性扩增产物等，但是造成PCR反应失败或结果不良的主要原因仅有两个：反应的非特异性和模板的二级结构。PCR反应既是热力学反应又是酶促反应。成功的PCR需要在最优条件下进行检测及扩增，同时每一反应组分都会可能影响结果。退火步骤是提高PCR反应特异性的关键步骤。退火时，若引物与模板结合特异性高，特异性PCR产物的产量就高，扩增反应的灵敏度也高。尽管如此，由于反应过程中引

3、物浓度高，引物可能与模板上非互补序列杂交形成错配。若引物与模板结合特异性低，就有可能产生非特异性产物及引物二聚体。引物设计及反应使用的化学试剂是决定PCR成功与否的关键。PCR引物设计最优的引物序列及合适的引物浓度是使PCR反应达到最高特异性及效率的关键。在QIAGEN实验方案及应用指南（英文版）的PCR部分您可以找到更多关于引物设计的信息。在设计PCR引物时需考虑以下几点（这也是在进行所有类型PCR实验时需要共同注意的）：■■解链温度(T)计算公式：2°Cx(A+T)+4°Cx(G+C)m■■避免两条引物在3’末端的2-3碱基发生互补■■

4、避免引物在3’末端与模板形成错配■■避免引物在3’末端C或G的数量等于或超过3个■■避免引物自身序列互补或者两条引物之间互补■■避免在引物3’末端以T结束■■确保引物与模板仅有一段互补序列■■反应中每一引物的浓度范围均为0.1–1.0μM。对于很多扩增反应来说，0.2μM的引物浓度就已经足够了2www.qiagen.comBROPCR初学者提示05/2013将冻干引物溶解于小体积的蒸馏水或者TE中制成浓缩储液。制备成小等份的工作液（浓度为10pmol/μl）以防止反复冻融。将所有的引物储存在–20°C。引物的质量可以通过变性聚丙烯酰胺凝胶电

5、泳进行分析；分析结果应为可见到单一的条带。PCR条件为使PCR反应高效进行，对每一对引物的反应条件都要进行优化，具体需要优化的项目为：PCR小提示：PCR反应要与PCR分析在各自独立的区域完反应缓冲液中的引物浓度和Mg2+浓度，及反应的退火温度。此外，加入添加物以提高DNA聚合成，以确保PCR反应所用的试剂不会被PCR产物污酶稳定性及持续合成能力、或者加入添加物以提高杂交严格性，或者采用能降低“引物——模染。相应的，PCR产物分析所用的移液器也不能用于板”非特异性反应的策略，这些方法都能改善PCR反应的效率。使用高纯度试剂对于PCR反应的P

6、CR反应。成功来说也很重要，特别是在扩增稀有模板（如基因组DNA上的单拷贝基因、或者被感染生物体基因组DNA上的致病病毒DNA等）时。加入对照反应对于监控PCR反应的成功十分重要。任何时候，只要可能，都要加入阳性对照，这可以检测PCR反应条件能否成功的扩增目标序列。由于PCR反应非常敏感，只要有很少的拷贝就能进行扩增，因此需要加入一个不含模板DNA序列的阴性对照，以确保PCR反应所用的试剂没有被模板DNA污染。引物退火特异性和PCR缓冲液在PCR反应中，退火发生在引物及其互补的DNA模板序列之间。引物的特异性退火是扩增反应成功的必要条件。为

7、了在短的退火时间内充分杂交，需要使用高浓度的引物，但是这样，引物在退火过程中也会与非特异性序列结合。非特异性退火的扩增产物与特异性扩增产物产生竞争从而会极大的降低特异性产物的产量。成功的PCR实验很大程度上取决于引物特异性结合产物相对非特异性结合产物的比例系数是否足够高。退火过程主要受到PCR缓冲液中的各种组分（特别是各种离子条件）和退火温度的影响。特定的阳离子组合在一起能够帮助引物在更广泛的退火温度范围内保持退火特异性。这样就不再需要针对每一对“引物—模板”系统进行退火温度的优化，而且允许不同退火温度的引物同时在非理想条件进行PCR扩增实

8、验。BROPCR初学者提示05/2013Sample&AssayTechnologies3均衡的离子组合促进了引物的特异性退火常用的PCR缓冲液通过阳离子与DNA主链上带负电的磷