蚀斑形成试验操作技术与方法.doc

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1、蚀斑形成试验操作技术与方法【操作法】1.制备CEF细胞单层培养板（24孔、12孔、6孔）,细胞量要求2xl0Mxl06/ml,每孔可加1〜3ml细胞悬液.37°C温箱培养，•待形成单层后接毒.，在接毒前先用不含血清培养液淋洗…次.2•待检病毒液样品将病毒液用含2%犊牛血清（CS）的缓冲液作10倍系列稀释，取其适为稀释度（KT'〜IO'8）,每一稀释度接种3个5厘米直径的培养皿（相当于6孔细胞培养板的3个孔），每一孔接入稀释的毒液0.01〜0.1ml,同时设2个不接毒液的对照培养孔，让病毒37°C温箱屮吸附60〜90min,再用3〜5ml预热的不含血清

2、的缓冲液轻轻淋洗一次细胞单层，然后再加入3〜5ml含2%犊牛血清的营养琼脂培养基（制备琼脂培养基，制备高压蒸汽灭菌的1.8%琼脂（优质Agar-Noble）溶液，这可以提前准备好放在4°C备用。用前水浴融化，待冷至46°C〜47°C再加等体积2倍浓缩的含4%犊牛血清的预热45C的培养基）放室温停留约15min待琼脂凝固后，再返回温箱继续培养。此时培养皿应翻面孵育，因为此后病毒会分散于琼脂表面，从而污染同一•培养物内的其它蚀斑，翻过来可以防止液体在琼脂面流动。3.随时检查细胞单层生长状况和琼脂培养基颜色并制备染色培养基（PH7.2〜7.4）,给含2%犊

3、牛血清的培养基小加入1/100体积的1%屮性红水溶液（高压灭菌），然后每培养孔加入3〜5ml（厚度2〜3mm内），让其在培养箱屮过夜。4.将细胞培养板取出移去染色培养基再将培养板返冋温箱1〜2h,然后在白色衬底上清楚地看到红色背景屮不着色的蚀斑。计出每一稀释度平均蚀斑。注：既然中性红只染活细胞，蚀斑只出现在红色背景的清亮区，应该设置已知无关联病毒的蚀斑对照以便识别。染色过的培养物在细胞单层溶解前还可以在温箱继续培养保持1或2天，在此期间，每天数蚀斑两次，观察培养板孔是否出现新的蚀斑以及成双的变大的蚀斑。5•应用将检验合格的同一批细胞毒液，逐瓶抽样等量

4、混合于一灭菌容器内，用Hank's将病毒液10倍系列稀释，取101010“三个滴度分别接种细胞生长良好的CEF单层培养板上,接种量为0.010.1ml/孔,37°C吸附2小时，然后吸出病毒液,淋洗一次,再覆盖含2%犊牛血清的营养琼脂，每孔2〜5ml,待凝固后，将培养板倒置，37°C培养48〜96小时;再覆盖含0.01%中性红的营养琼脂,每孔3〜5ml,待其凝固后，将瓶倒置,37°C培养24小时，再移去染色培养基，返回温箱1〜2小时，在白色衬底上清楚地看到红色背景屮不着色的蚀斑。再记录出每一稀释度平均蚀斑。附：鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗效力检验下

5、列方法任择其一。3.7」蚀斑计数检验每批疫苗制造培养瓶抽取4瓶，将检验合格的同-•批细胞毒液，逐瓶抽样等量混合于一灭菌容器内，用Hnnlcs将病毒液10倍系列稀释，取10弋10IO'三个滴度分别接种三瓶(50ml细胞培养瓶)生长良好的CEF单层上，接种量为1ml/瓶，37°C吸附2小时，然后倒去或吸出病毒液，覆盖含5%犊牛血清的DMEM营养琼脂，每瓶8ml，待凝固后，将瓶倒置，37°C培养48小吋；再覆盖含1/100体积的1%屮性红的营养琼脂，每瓶8ml，待其凝固后，将瓶倒置,37°C培养24小吋，记录蚀斑数，每羽分含毒量=1.Ox104Pfuo3

6、.7.2用鸡检验取疫苗样品，每只按1个使用剂量翅膀内侧无血管处刺种20H龄至4周龄的SPF鸡20只，同吋设立非免疫对照鸡20只。免疫后4周，将免疫组和非免疫组的鸡随即分为两组,分别用FPV102株(毒种每0.1ml含1056EID50)攻击，将毒种作10()()倍稀释，羽毛囊接种，接种鸡表现为毛囊潮红、肿胀、丘疹、水泡和结痂和ILTVWG株(毒种每0.1ml含105-9EID50)攻击，将毒种作1000倍稀释，喉囊内接种0.4ml/羽，接种鸡岀现流涕和湿性啰音，咳嗽和喘气，呼吸困难等一系列症状。对照鸡的发病率不少于7只，免疫鸡至少保护7只，疫苗效力判

7、为合格。3.8剩余水分测定用真空烘干法或费休氏法测定冻干疫苗屮的剩余水分不应超过4%o3.9真空度测定用高频火花真空测定器进行密封后容器内的真空度的测定，均应出现白色、粉色或紫色的辉光。鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗含毒量蚀斑数，每毫升应＞3.Ox106Pfu()。