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1、病毒蚀斑技术1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virusplaqueformation)成为许多病毒的滴定和研究方法。(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒
2、，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103，则
3、病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)(二)技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。1.病毒生物学纯化(Virusbiologicalpurification)在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时,有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒,
4、亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化,必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。2.蚀斑减少中和试验(PlaqueReductionNeutralizationTest)蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感
5、性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作,接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。由于本试验的操作比较繁锁，目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典(第六版)中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。(三)操作实例1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化(1)于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养
6、绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。细胞培养时间约3－4天，接种量约为2000000/ml个细胞。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。(2)用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。(3)每个稀释度的病毒液接种3个平皿。(4)接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。(5)每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时，每15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。(6)按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。(7)取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.
7、5％琼脂(预热)中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天，平皿需倒置。(取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2％琼脂(预热)中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中培养至次日。(9)结果计算求每组三个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律(即若10-2组平均100个蚀斑，则10-3组平均应在10个左右)，否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。(10)选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备
8、的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。(11)本试验采用BHK21细胞
