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1、纤维素分解细菌的分离和鉴定一・实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定.2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥屮筛选出3株分解纤维素的细茵。3.通过PCR克隆这3株茵的16srDNA并与相似菌株做比对.进一步构建分子进化树.来研究其分类情况。4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S「DNA发育树构建结果等分类依据。%1.实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性.无芽砲、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。丿应为其第二部分滑动细菌或笫七部分的假单胞菌类。由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水
2、交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的了实体。将灭菌的滤纸醮取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15°C下培养10比用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。：啦勵1.00g,MgS04・7H200.30g,NaCl0.lOg,FeC13O.01g,NaN032.50g,CaCi20.lOg,
3、琼脂18.00g,蒸镭水lOOOlnl,pH值7.0〜7.2.12TC灭菌20min。无淀粉滤纸（浙江富阳纸厂）用浓度1%的醋酸浸泡一夜后用浓度2%的Na-2C03水溶液洗至屮性，晾干备用。把上述处理过的滤纸剪成直径约为8ca的圆形滤纸片.放在干净的平1111屮，用报纸包好.采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P041.009,m.庐04'7H200.309oNaOO.109.FeC130・Olg,NaN032.50g.CaC120.lOg,竣甲基纤维素钠IO.00g,琼脂18・（X）g,蒸
4、懈水10130ml,pH值7・0—7.2,12TC灭菌20min«4、牛肉膏蛋白豚固体培养基；5、生理生化特征鉴定培养基。四、实验步骤:1、菌种分离菌种初筛。将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上,用接种环蘸取土样,点样在平板滤纸上，15°C下培养10止用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌,在贴有滤纸的初筛平板上划线，15°C下培养10d。重复此操作至菌种初步纯化。2、菌种复筛。用接种环从已初步纯化的初筛平板上滤纸水解透明圈的菌落处，刮取菌种在复筛平板上划线，15°C下培养7d,得到单菌落。将分离纯化的单菌落I
5、叫接到初筛培养基上，观察其对滤纸的分解。将分离到的单菌落接种到牛肉膏蛋白豚培养基上。15°C下培养7d,4°C保留菌种或用作各种鉴定。3、菌种形态观察个体形态观察。对细菌进行革兰氏染色、荚膜染色和芽砲染色，观察结果；进行牛肉膏蛋H腺半固体培养基（含琼脂O.4%）穿刺接种，观察游动性；对菌体形态进行镜检，菌体大小采用数字显微图像处理软件MIE测量。4、菌落形态观察。在复筛培养基上15°C下培养7d,进行菌落形态观察。5^菌株最适温度与ph的测定将筛选菌株分别在II、15、20、25、29、37°C下涂布培养5d（密度不可过高），至
6、少选取加个单菌落测量其肓径，绘制3株菌的单菌落平均真径随温度的变化曲线，作为最适生长温度的参考。同样.不同pH梯度下涂布培养5d,测量单菌落平均育径，绘制其随pH的变化Illi线，作为最适生长pH的参考。6、生理生化特征鉴定采用“1.2.4”所述的生理生化反应鉴定培养基对筛选的3株菌讲行鉴定。7、16srDNA鉴定菌株VCR模板制备㈣9。取培养3d的平板单菌落悬于50m无菌蒸馅水中，于10（）°C水浴5—10min,取出立即放置冰上，保存。16SrDNA的PaR扩增与测序。采用上海生工生物工合成的1对16SrDNA引PCR扩增条
7、件:94°C预变性5rain,94°C变性45s.50°C退火45s,72°C延伸,50111反应体系30个循环后再72°C延伸5min。8、序列比对与系统发育树的构建。将测得的16SrDNA序列在Genlhnk±进行BLA.gl”比对，对获得的同源序列进行序列分析。取同源性较高的不同种的模式序歹ll（TypeStrain）用MEGA4010：进彳亍多序列比对并构建系统发育树。五、结果与分析：1、菌株的筛选通过菌株的初筛、复筛和同接试验，共分离出15种具有纤维索降解活性的菌株。其屮的13株细菌,分别命名为WHI—WH13o测量1
8、5°C下培养10d的滤纸分解圈.WH12平均为7.0咖.WH3为5・5rrlin,Will为5.Oml'n,其他菌株均在3・0mm以下。选取菌株Will、WH3、WH12继续研究。菌株wH12对滤纸分解能力最强・15°C下培养10d•该2、菌种形态观察结果1个体
