聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化

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1、第5卷第1期过程工程学报Vol.5No.12005年2月TheChineseJournalofProcessEngineeringFeb.2005聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化1,223122杨瑞娥贠强陈婷谭天伟马光辉苏志国(1.北京化工大学化学工程学院北京100029;2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室北京100080;3.北京科技大学生物工程系北京100083)摘要采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF考察了各因素对蛋白质平均修饰度及体外生物活性的影响并对修饰产物的稳定

2、保存条件进行了初步探讨.通过四因素四水平正交法和单因素实验结合优化修饰条件为PEG与G-CSF摩尔比为25:1,pH7.6的硼酸盐缓冲环境反应时间40min反应温度22.在此条件下PEG-G-CSF的平均修饰度为50%活性可保留40%左右.研究还发现不同的添加剂影响PEG-G-CSF的保存稳定性人血清白蛋白和甘露醇是两种效果最好的保护剂在它们的存在下PEG-G-CSF溶液在4放置一个月后活性保留92%三个月后保留51%.关键词粒细胞集落刺激因子(G-CSF)单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰生物活性中图分类号Q511文献标识码A文章编号100

3、9-606X(2005)01-0086-041前言应条件进行优化探讨了各因素对修饰度大小和G-CSF生物活性的影响以及修饰度和生物活性之间的关系同[1]1977年Abuchowski等用单甲氧基聚乙二醇时确定了PEG-G-CSF偶联物的稳定保存条件.(CH3O-[CH2-CH2-O]mCH2CH2-OH简写为mPEG)对牛血清白蛋白和过氧化氢酶(小牛肝脏)进行化学修饰2材料和方法后发现用聚乙二醇偶联之后的蛋白质免疫原性和抗原2.1仪器与材料性大大降低表观分子量和在体内的循环半衰期明显增F-4500荧光仪(日本Hitachi公司)450型酶联免加

4、.随后人们用mPEG对L-天冬酰胺酶超氧化物岐化疫检测仪(美国Bio-Rad公司).酶a-干扰素粒细胞集落刺激因子等多种药物蛋白进荧光胺(Sigma),MTT(Sigma),RPMI1640(Gbico行了化学修饰表明用mPEG修饰后的蛋白可以减少人BRL公司),96孔细胞培养板(Costar公司),rhG-CSF效体对药物蛋白的免疫反应延长药物在体内的循环时[2]价测定用参考品(中国药品生物制品检定所),间同时达到减少注射频率和药物毒副作用的目的.rhG-CSF(北医联合生物工程公司).标准蛋白购自上海粒细胞集落刺激因子(Granulocyt

5、eColonyStimu-丽珠东风生物技术有限公司.试剂均为分析纯或生化纯,latingFactor,G-CSF)是刺激骨髓细胞集落形成的集落细胞系为NFS-60细胞株(中国药品生物制品检定所).刺激因子之一它能够特异性地刺激和调节粒细胞系统2.2方法的增殖分化存活和活化对于各种原因引起的中性2.2.1羧甲基化单甲氧基聚乙二醇的制备及活化[3]粒细胞减少症具有潜在的巨大的应用价值.但是重以分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇为原料通组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在体内循环半衰期过Williamson方法制备羧甲基化单甲氧基聚乙二醇再[4

6、]短t1/2仅为1.3~4.2h作用时间短暂限制了疗效.按照Gaertner的方法活化PEG详细步骤见文献[5].2002年FDA批准美国Amgen公司用PEG-G-CSF治疗PEG的活化反应式如下中性粒细胞减少症注射次数大大减少只需两周注射mPEG–O-CH2COOH+DCCI®mPEG–O-CH2COO-DCCI,1次而未修饰前G-CSF要天天注射.mPEG–O-CH2COO-DCCI+NHS®mPEG-O-CH2COO-NHS.药用蛋白所偶联的mPEG个数与蛋白的相对分子质量有一适宜的比例即每种蛋白质药物均有其最佳的其中DCCI为二环己基

7、碳二亚胺NHS为N-羟基琥珀平均修饰度.而最佳修饰度的获得需要控制反应条件酰亚胺.对于分子量为19600的G-CSF分子这方面的研究工2.2.2PEG修饰G-CSF作还较少.本实验采用正交法对PEG修饰G-CSF的反修饰反应式如下收稿日期2004-01-08修回日期2004-04-19作者简介杨瑞娥(1979-)女河北省承德市人硕士研究生生物化工专业苏志国通讯联系人.万方数据第1期杨瑞娥等聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化87mPEG-O-CH2-COO-NHS+Protein-NH2®mPEG-O-CH2-CONH-Prote

8、in.将G-CSF经凝胶色谱柱SephadexG-25(柱体积52.2.6PEG-G-CSF偶联物的稳定性mL)置换到不同pH值的缓冲液中测定蛋白浓度