非典型肺炎(SARS)实验室培训).ppt

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1、SARS的实验室检测湖南省疾病预防控制中心张红2003年4月20日确定病原的原则要从病人中分离培养出病原。要有血清学的支持证据，即绝大部分病人的血清应能与所分离的病原反应。将分离病原感染动物，在动物模型上重复出与临床表现类似的特征。SARS的病原学研究第一部分：排除多种传染病第二部分：排除禽流感第三部分：衣原体及相关研究第四部分：冠状病毒第五部分：国际研究进展排除多种传染病鼠疫(plague);肺炭疽(anthrax);钩端螺旋体(leptospira);军团菌(Legionella).结核菌（tuberclebacillus，TB）支原体(P

2、PLO)排除多种传染病腺病毒（Adenovirus)，流感病毒(Influenzavirus)，禽流感病毒(Avineinfluenzavirus)，麻疹病毒(Mealsvirus)，副流感病毒(Parainfluenzavirus)，出血热病毒(hemorrhagicfevervirus)；呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)；肠道病毒（Enterovirus)排除禽流感对与香港病人有接触及密切接触的75人，分别采集咽拭子和血清标本进行检测；其中对67份咽拭子标本接种鸡胚，病毒分离及病原检测均为阴性；采用半加敏

3、HI法，对75份血清标本进行甲型流感病毒H5和H9抗体测定，结果均为阴性(HI效价<1:5）；用H5引物进行的RT－PCR扩增，结果为阴性；截止目前所有接触及密切接触的75人均未患非典型肺炎；结论：福建平潭县未见禽流感及非典型肺炎出现。流感病毒分离广东162份病人标本同时接种MDCK细胞和鸡胚仅分离到两株乙型流感病毒但未分离到禽流感病毒（Avianinfluenzavirus)。2002年11月－2003年1月，广东地区流感监测点共采集529份标本，分离到43株流感病毒，未见禽流感病毒。全国同期流感监测点共采集3206份标本，分离到294株流感

4、病毒，未见禽流感病毒。禽流感病毒血清学检测用美国CDC提供的试剂（1997年）对中山市7例、广州市20例病人的双份血清及1份病人恢复期血清做禽流感病毒（H5N1）血凝抑制实验，除1例恢复期血清为可疑（滴度1：20）其余54份均为阴性（HI效价10）。此前广东省疾控中心曾对这些标本中的30份（15对)血清标本进行过同样实验,结果相同。对另外36份恢复期血清的H5N1的血凝抑制实验，显示所有标本均为阴性（HI效价10）。对30份健康人血清标本进行血凝抑制实验，结果显示所有标本均为阴性（HI效价10）。禽流感病毒的分子生物学检测对3份尸解肺组织

5、标本用WHO推荐的禽流感病毒基因（M，NP，H5）特异引物进行RT－PCR反应，结果均为阴性；对8份存在可疑血凝活性（HA）的鸡胚尿囊液和1例咽拭子标本进行H5N1流感病毒全基因组扩增，结果均为阴性。对1例病人含漱液标本进行H5N1病毒基因扩增，仅M基因为阳性，经与国际基因库（GenBank)比较，显示为甲型流感病毒序列。衣原体及相关研究电子显微镜观察免疫荧光检测病原体组织培养组织培养病原体电镜观察组织培养物的免疫荧光检测药物敏感性研究血清学检测电子显微镜观察对所收集的来自不同地区、不同医院、死于非典型肺炎的5个病例的标本，电镜观察表明5例肺组

6、织肺泡上皮细胞被破坏，肺泡腔充满渗出液，胞浆内均可见典型的充满衣原体颗粒的包含体，大小不等的原生小体(EB)和网质小体（RB）两种颗粒均可见到，在肺毛细血管和肺泡渗出液中也发现有衣原体样颗粒（Chlamydia-likeagents)。在病人的心、脾、肝、肾和淋巴结等组织中均可见到典型的衣原体样颗粒和包含体。免疫荧光检测第四例病人脾脏压片，用6份病人血清进行免疫荧光检测，其中5份血清在脾脏细胞浆内检测到典型荧光反应，且荧光有致密灶，胞核内未见荧光分布。用第五例病人的淋巴结涂片与13份病人血清进行免疫荧光检测，全部为阳性且荧光也局限在细胞浆内。提

7、示引起本次肺炎的病原体存在于细胞浆内（病毒/衣原体）。病原体组织培养将病人肺组织匀浆液用青、链霉素和红霉素处理后，接种10种组织培养细胞和鸡胚，观察细胞病变进行病原体的分离。293细胞，HeLa细胞，Vero-E6细胞，2BS细胞，RDa细胞，Hep-2细胞，人胚肾细胞，人胚肺细胞，BHK细胞，MDCK细胞，鸡胚。4种组织培养细胞病变组织培养病原体电镜观察经第3次传代的4种感染细胞进行超薄切片、电镜观察，也发现了典型的衣原体样颗粒(Chlamydia-likeagents)和包含体。进行电镜检查之前，在染色的半薄切片中也可见到大量的衣原体样颗粒

8、及包含体。组织培养物的免疫荧光检测用5份病人血清对组织培养细胞进行免疫荧光检测，其中2份确定为阳性，其它标本荧光较弱，结果可疑。目前正在进行多份病人急