实验三 培养基的制备与灭菌.ppt

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1、实验三培养基的配制、分装和灭菌一、实验目的明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物培养基的原材料：碳源、氮源、无机盐、生长因素、水二、基本原理根据微生物的种类和实验目的不同，培养基有不同的种类按成分：天然培养基，合成培养基，半合成培养基按物理状态分：固体培养基，半固体培养基，液体培养基牛肉膏蛋白胨培养基三、实验器材与试剂溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂1mol/LNaOH、1mol/LHCl仪器或其它用具：三脚架、培养基

2、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅等称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→搁置斜面四、操作步骤1）称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2）加热溶化：在烧杯中加入少于所需要的水量，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则加入琼脂再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3）调pH：检测培养基

3、的pH，若偏酸，可逐滴滴加1mol•L-1NaOH边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol•L-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4）过滤趁热过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。固体分装5）分装：披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一

4、半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝半固体液体分装试管三角烧瓶试管三角烧瓶1/3<1/4<1/2<1/5<1/26）加塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。以阻止外界微生物进入培养，并保持良好通气性7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞8）灭菌：将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸气灭菌9）搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。培养基分

5、装斜面制作包扎成捆挂标签附：高压蒸汽灭菌法1．加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。2．装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3．加盖将盖上的排气软管插人内层的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋转相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4．排气加热，待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。5．升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。6．保压当压力表指针达到所需压力刻度时

6、，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121℃，20min灭菌。7．降压达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。8．无菌检查将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。注意事项：使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。