DB34∕T 3101-2018 猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.20B16DB34安徽省地方标准DB34/T3101—2018猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPseudomonassyringaepv.actinidae文稿版次选择2018-04-16发布2018-05-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T3101—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安

2、徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农业科学院园艺研究所。本标准主要起草人：杨雪、陈雨、高同春、戚仁德、姚剑、齐永杰、张金云、伊兴凯、张爱芳、谷春艳、李云飞、臧昊昱。IDB34/T3101—2018猕猴桃溃疡病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了猕猴桃溃疡病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于猕猴桃的苗木、枝叶、花蕾中猕猴桃溃疡病病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新

3、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3猕猴桃溃疡病菌的基本信息3.1病原菌：丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonassyringaepv.actinidae）3.2分类地位：属细菌界Bacteria，蛋白菌门Proteobacteria，变形菌纲GammaProteobacteria，假单胞目Pseudomonadales，假单胞科Pseudomonadaceae，假单胞属Pseudomonas。其他信息参见附录A。4方法原理本方法以PCR鉴定和致病性鉴定为主要

4、判定依据，猕猴桃溃疡病菌的形态特征作为辅助鉴定依据。5仪器设备5.1高速离心机：转速≤15000r/min5.2涡旋振荡器5.3PCR仪5.4高压灭菌锅5.5恒温培养箱：20℃～30℃5.6冰箱：4℃、-20℃、-70℃5.7恒温水浴锅：4℃～100℃5.8电泳仪5.9凝胶成像仪5.10可调移液器：1-10μL，10μL-100μL，100μL-1000μL5.11天平：精度0.001g5.12纯水仪5.13超净工作台1DB34/T3101—20186试剂和培养基除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符

5、合GB/T6682中三级水的标准。6.1PCR试剂：2×PCRTaqMasterMix6.2凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE电泳缓冲液（参见附录B.1）6.3培养基：细菌培养基（参见附录B.2）7实验室鉴定7.1病原菌分离与纯化将疑似猕猴桃溃疡病的发病组织用70％乙醇表面消毒后，挑取少许病健交界处的新鲜病组织放到无菌的培养皿中，加入0.5mL的无菌水，用玻璃棒碾碎后静置30min，在细菌培养基上划线培养。28℃培养2～3d后，挑取乳黄色单菌落用液体细菌培养基摇培，28℃培养1d，-20℃保存备用。7.2PCR鉴定7.2.

6、1病原菌DNA提取采用商业化试剂盒提取疑似分离细菌DNA。7.2.2PCR引物引物序列为：Psaf1（5’-TTTTGCTTTGCACACCCGATTT-3’）、Psaf2（5’-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’）。7.2.3PCR体系反应体系为：2×PCRTaqMasterMix25μL，10μmol/L引物各2μL、DNA4μL，灭菌双蒸水补足至50μL。7.2.4PCR程序反应程序为：95℃2.5min；94℃30s，52℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃8.5min。7.2.

7、5PCR结果判定PCR鉴定用标准猕猴桃溃疡病菌DNA作阳性对照，无菌水作阴性对照。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，用凝胶成像系统分析。若阳性对照出现一条280bp的DNA片段，阴性对照没有条带，待鉴定菌株能扩增出该280bp的片段，则判定为猕猴桃溃疡病菌。7.3致病性鉴定根据科赫氏法则，用分离鉴定的猕猴桃溃疡病病原菌接种健康的猕猴桃组织诱导发病，观察发病症状与田间猕猴桃溃疡病自然发病症状是否一致（参见附录A.2）。8结果判定如PCR鉴定结果符合7.2.5，且致病性鉴定结果符合7.3，则判定为检出

8、猕猴桃溃疡病菌。2DB34/T3101—20189样品、菌株保存9.1样品保存9.1.1检疫鉴定后保存样品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于-70℃冰箱保存。9.1.2保存期为一年，有特殊需求保存期可适当延长。9.1.3保存期满灭活处理。9.2菌株保存9.2.1分离并鉴定为猕猴桃溃疡病菌的菌株，应妥善保存。9.2.2