DB34∕T 2813-2017 梨炭疽病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.20B16DB34安徽省地方标准DB34/T2813—2017梨炭疽病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofColletotrichumgloeosporioidesPenz．文稿版次选择2017-03-30发布2017-04-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2813—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省检验检疫

2、科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：李云飞、陈雪娇、宗凯、杨雪、孙娟娟、郑海松、姚剑、陈雨、余晓峰、王满满。IDB34/T2813—2017梨炭疽病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了梨炭疽病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于果实、苗木及其制品中梨炭疽病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3、3梨炭疽病菌基本信息学名：ColletotrichumgloeosporioidesPenz.分类地位：真菌界（Fungi），黑盘孢目（Melanconiales）,黑盘孢科（Melanconiaceae），炭疽菌属（Colletotrichum），其有性阶段为围小丛壳（Glomerellacingulata）。传播途径：梨炭疽病主要借助雨水、昆虫等进行近距离传播，借助果实、苗木及其制品等的调运进行远距离传播。4方法原理根据梨炭疽病菌在寄主上的为害症状（参见附录A），培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器等形

4、态特征，以及PCR特异扩增片段大小进行结果判定。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂5.2.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的规定。5.2.21％次氯酸钠。5.2.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，CTAB裂解液（20g/LCTAB，0.1mol/LTris，1.4mol/LNacl，20mmol/LEDTA-Na

5、2），蛋白酶K（20mg/mL），苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，3mol/LNaAc(pH5.2)，异丙醇，70％乙醇，无菌水。5.2.4PCR试剂：10×PCRbuffer（含25mmol/LMgCl2），Taq酶，dNTP。1DB34/T2813—20175.2.5凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，EB。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂13.0g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至6.7，121℃高压灭菌15min。6

6、病菌的鉴定6.1分离培养挑取具有疑似症状的果实或植物组织，用解剖刀取植株病健交界处的组织，剪成约0.4cm×0.4cm小段，用1％的次氯酸钠溶液消毒60s，无菌水洗涤3次，灭菌滤纸吸干水分后置于PDA培养基上，在25℃～30℃，12h黑暗/12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第3d开始观察，根据组织周围新生菌落的形态进行选取，取边缘菌丝转接纯化。6.2鉴定特征PDA培养基上，菌落圆形，绒毛状，气生菌丝生长较密集；菌落初期白色，后期四周呈灰白色，中心逐渐转为灰黑色至墨绿色，背面可见粉红色分生孢子团，偶尔可见黑色圆点

7、散布其中。分生孢子盘圆形或近圆形，黑褐色，突起于培养基表面；分生孢子梗无色、圆柱形或棒状，其上着生单个孢子；分生孢子圆柱形、单孢、无色，大小为10μm～35μm×3.7μm～7.0μm，中间有一油滴，参见附录B。子囊壳暗褐色，烧瓶状，直径为85μm～300μm；子囊长棍棒形，平行排列于子囊壳内，大小为55μm～70μm×9μm，内含8个子囊孢子；子囊孢子单胞无色，卵圆形或长椭圆形，稍弯曲，12μm～22μm×3.7μm～5.0μm。6.3PCR检测采用商业化试剂盒或CTAB法（参见附录C）提取疑似分离物DNA，通过P

8、CR反应检测。用梨炭疽病菌DNA作阳性对照，其他真菌DNA作阴性对照，无菌水作空白对照。7结果判定若形态特征符合6.2中描述，且分离物PCR检测为阳性，即可判定检出梨炭疽病菌；否则，判定为未检出梨炭疽病菌。8样品保存8.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨炭疽病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高