实验 五 蛋白质纯化--盐析沉淀法.ppt

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1、实验五蛋白质纯化--盐析沉淀法一实验原理蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。上述现象是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。一实验原理盐析的一般操作步骤是，选择一定浓度范围的盐溶液（如0-

2、25%饱和度的硫酸铵）使部分杂质呈“盐析”状态从溶液中沉淀出来，经离心法去除。而目的蛋白质呈盐溶状态，存在于上清中。增加盐浓度（如25-60%饱和度的NH4SO4）使目的蛋白质呈盐析状态，而从溶液中分离出来。大肠杆菌BL21（DE3）pGEX-6p细胞裂解液，由上一实验提供分析纯硫酸铵：用干净的磁研钵研成细粉末。30%三氯乙酸,SDS-PAGE所需试剂二实验试剂1盐析曲线的测定对于一求知盐析特性的蛋白质来说，用盐析作为一纯化步骤时，应首先用实验确定使此种蛋白质盐析沉淀出来的最佳饱和度，其测定方法如下：（1）取7支微量离心管，用记号笔在管帽上标记20%、30%、40

3、%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述离心管作容器分别称取磨细的硫酸铵晶体末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；三操作步骤（3）分别向上述装有（NH4）2SO4粉末的离心管中添加0.5ml细胞裂解液，充分振荡使（NH4）2SO4溶解后，在室温下静置2小时；（4）将离心管放置于离心机中，以1000转/分转速离心5分钟后，倾去上清，倒立离心管，以便尽可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸馏水及8μl30%三氯乙酸混匀,静置10分钟后,离心,尽量去除上清；(因此步会造成蛋白质不溶影响后续工作，所以省略

4、)三操作步骤（6）将离心管置于快速干燥器中干燥30分钟；（7）向离心管中添加100μISDS-PAGE上样缓冲液悬浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分钟，取出置-20℃冰箱中备用；（8）制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶；按下列上样顺序向加样孔中添加10μl样品：样孔12345678910包涵体样20%30%40%50%60%70%80%包涵体空白对照电泳分离后，染色、脱色、观察目的蛋白质出现在何种浓度的（NH4）2SO4盐析样孔中，以确定最佳的盐析条件。三操作步骤2盐析（1）将50ml细胞裂解液置于100ml烧杯中，加入搅拌磁棒后放置在磁力搅拌器上（2）在搅拌状态下缓缓加入研细的

5、（NH4）2SO4末至最佳饱和度之前的一级饱和度，静置2小时后,离心得上清（3）在搅拌下向上清中添加研细的（NH4）2SO4粉末，使终浓度达最佳饱和度，静置2小时后离心收集目的蛋白沉淀（4）将沉淀的蛋白质溶解于尽量小体积的磷酸盐缓冲的生理盐水中，用Bradford试剂测定蛋白质浓度后，置-20℃冰箱中保存备用。三操作步骤1.为提高蛋白质盐析分离效率，应采取哪些措施？2.为测定用硫酸铵盐析法分离某种蛋白质的最佳硫酸铵浓度，除采用本讲义设计的操作程序之外，请你设计另一种工作程序测定盐析目的蛋白质的硫酸铵最佳浓度，并指出两种方法的优缺点。3请你计算25℃时60%饱和度的硫

6、酸铵溶液的离子强度。四思考题