盐析法分离蛋白质.ppt

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1、第4章盐析法知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。难点：常用沉淀方法的灵活运用。沉淀定义沉淀特点应用范围沉淀分类1.沉淀法概述盐析法有机溶剂沉淀法选择性变性沉淀法等电点沉淀法离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法高价金属离子沉淀法沉淀法分类活性蛋白非活性蛋白理化性质溶解度提取方法蛋白质的理化性质的回顾盐析沉淀步骤加沉淀剂方式陈化条件脱盐处理2.盐析沉淀盐析机

2、理示意图①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。盐析的机理Cohn方程式logS=β-KsIKs盐析β盐析二次盐析盐析沉淀基础图1碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图不同蛋白质的溶解度曲线蛋白质的盐析分布曲线溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b)对β影响对Ks影响盐种类盐浓度温度pH值盐析影响因素无

3、机盐种类的影响图7不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）(○)NaCl;(▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)NH4)SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)柠檬酸三钠温度的影响pH对β的影响蛋白质起始浓度的影响二次盐析盐析操作3等电点沉淀实例①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入

4、一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。4有机溶剂沉淀原理图有机溶剂沉淀实例酵母干粉中加入0.066mol/L磷酸氢二钠溶液，37℃水浴保温2h，室温搅拌3h，离心收集上清液，升温至55℃，保温20min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较

5、高的醇脱氢酶。5选择性热变性沉淀实例（1）非离子型聚合物沉淀法（2）聚电解质沉淀法（3）金属离子沉淀法（4）亲和沉淀6其他沉淀法凝聚技术絮凝技术7凝聚和絮凝技术第五章沉淀法课后练习名词解释：盐析法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，等电点沉淀法，盐溶，盐析，β盐析，Ks盐析，二次盐析盐析的机理有机溶剂沉淀的机理二次盐析如何实现？