协会团标-商品化检测试剂盒-克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌） 方法一-正文.pdf.pdf

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1、商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）方法一（征求意见稿）Commercialkitmethod–Cronobacterspp.(Enterobactersakazakii)-MethodI前言本标准主要参照AOACOMA2018.01标准起草本标准起草单位：东北农业大学；3M中国有限公司；中国营养保健食品协会本标准主要起草人：姜毓君；满朝新；张微；孟云；陆苏飚；黄炎；王梦婷21范围本标准规定了食品及食品加工环境中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的3MMDS克罗诺杆菌属分子检测法。本标准适用于食品及食品加工环境样品中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的

2、检测及快速筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1食品安全国家标准食品微生物检验总则GB19489实验室生物安全通用要求。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验3生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物和废弃物的处理应按照GB19489有关规定执行。4方法原理MDS克罗诺杆菌属分子检测法利用环介导等温扩增技术快速扩增克罗诺杆菌属高特异

3、性的核酸序列，并结合生物发光技术来检测扩增过程中的荧光信号，通过检测系统的软件实时报告阳性结果（波峰），阴性结果在60分钟运行结束后自动进行判定。5设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1恒温培养箱：37℃±1℃；5.2电子天平：感量0.1g；5.3均质器（旋刀或拍击式）或等效设备；5.4pH计或精密pH试纸：精密度0.1；5.5微量移液器及无菌带滤芯吸头；5.6干浴加热器：100℃±1℃。35.73M分子检测仪及配件：5.7.1分子检测仪5.7.2加热模块5.7.3冷却模块5.7.4开盖器5.7.5试剂管架5.7

4、.6快速转移托盘5.7.7分子检测仪软件6培养基和试剂6.1缓冲蛋白胨水(BufferPeptoneWater,BPW)6.2缓冲蛋白胨水-万古霉素(BPW-Vm)6.33M克罗诺杆菌属分子检测试剂盒6.3.1裂解管6.3.2试剂管6.3.3试剂对照管6.4检测程序食品：检样100g(mL)+BPW900mL环境样品：1份海绵涂抹样品+BPW225mL注：含益生菌的食品：检样100g(mL)+900mLBPW-Vm37℃±1℃，18h-24h每个样品吸取20µL到裂解管进行裂解100±1℃加热15min，再冷却5min-10min吸取20µL裂解

5、液到试剂管，然后放入分子仪器进行扩增、检测结果报告47操作步骤7.1增菌7.1.1食品：取待检样100g（mL）置于盛有900mL已预热至37℃BPW的无菌锥形瓶中，用手缓缓摇动至充分溶解，或置于盛有900mL已预热至37℃BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，然后37℃±1℃培养18h-24h。如果食品中含有益生菌，则使用BPW-Vm，然后37℃±1℃培养22h-24h。BPW或BPW-Vm可以放置于37±1℃的培养箱内预热。7.1.2食品加工环境样品：取1份海绵涂抹样品（含10mL稀释液），加入225mL已平衡至室温的B

6、PW，用手轻轻挤压海绵至少5次以上，充分混合样品，37℃±1℃培养18h-24h。7.2裂解7.2.1将裂解管平衡到室温，进行倒置混合后，利用开盖器打开裂解管盖。轻轻摇动培养过的样品混合物，用移液器吸取20µL至裂解管。如果海绵涂抹样品里含影响扩增反应的成分，则吸取10µL增菌液至裂解管。移取完所有样品后，吸取20µL的无菌BPW到新的裂解管中，作为阴性对照，请勿将水用作阴性对照。如果食品中含有益生菌，吸取20µL的无菌BPW-Vm到新的裂解管中，作为阴性对照。7.2.2将无盖裂解管架放在加热模块中，100℃±1℃加热15min±1min。从加热

7、模块中取出无盖裂解管架，将其放进冷却模块冷却5min，直至裂解管颜色由黄色变为粉色，然后将裂解管架移出冷却模块终止冷却，整个冷却时间不超过10min。7.3扩增与检测7.3.1吸取每支裂解管液体上半部分中的20µL样品裂解液（避免吸出沉淀），贴壁轻轻倾斜注入新的试剂管中，以避免搅动试剂管中冻干小球，轻轻上下吸动5次充分混合。转移完后，使用开盖器将附加盖盖紧试剂管盖子。当转移完所有样品裂解液后，分别吸取20µL阴性对照裂解溶液转移到试剂管和试剂对照管中，按上述相同方式充分混合。配置完后立即将盖紧的试剂管放入试剂管架。57.3.2将试剂管架从样品制备

8、区转移到扩增区，将试剂管放入快速转移托盘，关闭并锁定托盘盖，将快速转移托盘放入分子检测仪，并在分子检测仪软件上输入检测相关信息，关闭盖子