草履虫的单克隆培养及接合生殖的研究设计报告.doc

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1、草履虫的单克隆培养及接合生殖的研究实验设计报告（生技一班第五组）实验目的1.增加实验探究能力，学习与掌握简单的单细胞动物的单克隆培养的方法。2.通过观察草履山的接合生殖，了解这种生殖方式的过程、期间各细胞结构的变化及外部条件对其影响。3.探究动物各种繁衍方式的意义。实验原理1.通过单克隆培养技术可以获得纯系草履虫。2.接合生殖是有性生殖的一•种，为两种不同交配型且是互补型的草履虫，在经过多次离心去养料后，处于饥饿条件下，会发生接合现象。3.在接合生殖过程屮，草履虫的细胞核会发生一系列变化。实验器材与材料草履虫粗液，稻草30g,而粉，蒸饰水，碱性品红染料；体视显微镜，

2、显微镜，离心札精密电子称，恒温箱，电炉，铝锅，医用多孔塑料板，小表血皿，双凹皿，试管，滴管，毛细滴管，移液枪，烧杯，漏斗，盖玻片，载玻片，面粉，试管架，标签纸，记号笔。实验步骤%1.材料的制备1.稻草培养液的制备：将稻草顶端的叶片和基部数节去掉，留屮部10-20cm长的一段，并将其剪成2~4cm的小段，称30g,先用蒸倔水冲洗，后加1000ml蒸倔水煮沸约40min,并随吋添加蒸发掉的水。倾出培养液，倒入锥形瓶屮，用对折报纸封口，冷却24小时都，过滤备用。（在稻草培养液屮，添加煮沸10分钟的小麦粒16颗，培养效果还是更好；制备好的培养液放入冰箱冷藏室中保存）2.湿房

3、的制备：取2~3张滤纸或报纸，将其对折放置搪瓷盘屮，想起加入适量的水，使滤纸浸湿即可，盖上盖子。3.培养皿的准备：选取两个洗净的有24个培养孔的医用塑料反应器，并且编上号码。然后用胶头滴管向每个培养孔小加入等量的培养液（约半毫升，不用过多，否则不方便观察，培养过程屮随吋补充）。%1.草履虫的单克隆培养1.草履虫的接种：将草履虫初液屮的草履山分成单个的接种到培养皿屮的稻草液屮。先从草履虫粗液屮吸取一小滴放在载玻片上，加蒸馆水稀释，在体视显微镜下观察，用微细的毛细滴管（或移液管）吸出部分液体地在另一-张载玻片的屮央，在加入清水稀释，再从屮吸出部分，滴入另一张玻片屮央清水

4、屮，如此反复，最终得到单个草履虫，将其放进分配好稻草液的培养皿屮。以此方法，完成两个塑料板的接种。2.对照培养：将两个恒温箱的温度分别设定在22°C和25°C（温度可自选），将上述两个報料培养皿放入事先准备好的湿室屮，盖上盖子，贴上标签，分别放入两个恒温箱屮培养，并定期观察其生长状况。3.扩大培养，当每个培养孔中的草履虫繁殖到一定数冃吋，将其移入较大试管屮，使其能够快速增长。注意每支试管应贴上标签（标签适当靠近试管口，便于放在试管架上吋观察），然后全部放如25°C的恒温箱屮培养，定期观察。%1.草履虫的接合生殖1.结合型的寻找%1离心：挑选出密度比较高的15貝试管进

5、行离心操作，使它们处于饥饿状态利于发生接合生殖。离心前可用电子称平衡。先放一只烧杯让示数归零,再分别称两支试管的重量，以较重者为标准，向较轻试管的离心套管屮加蒸倔水，只要相对应两支试管加上离心套管重量一样即可，注意二者一样重时再称一次后一支的重量，以防水加在烧杯而未进入试管套。离心吋用转速3000r/min,一次离心四分钟，要立即取出并用对应编号的胶头滴管吸取上清液（尽量不要晃动，以防草履虫再次回到丄层液体）。将15支试管依次编为1到15,并取15只胶头滴管对应编为1到15o第一次去密度较大的草履虫液3ml,加入蒸徭水lml,离心4min,用对应胶头滴管吸取上清液2

6、.5ml；再加入2.5ml蒸锚水进行第二次离心，时间同样4min,用对应胶头滴管吸取上清液2.5ml；在以同样方法进行第三次离心，此吋尽量吸取上清液，剩下lml即可。全部离心后，胶头滴管放入对应的试管屮。%1配对：胶头滴管吸取对应lml高浓度草履虫液，lml草履虫液可与另外3到4屮草履虫配对，最后15支试管共配对26组，用小培养皿培养，编号A到乙%1观察：观察几分钟后用湿房放回20°C培养箱，过20min后再拿岀来观察（一直在灯下观察，高温可能导致草履虫死掉）。并适吋添加蒸馅水。2.草履虫装片制备：用毛细吸管取出一对结合的草履虫与载玻片屮央，在液滴四周用面粉糊（加水

7、不要过多），面粉糊点要高而小（既有固定作用，并且染色吋更容易）；将盖玻片小心盖在面粉糊上，将装片立即置于体视显微镜下观察，边观察便用铅笔的橡皮头轻压载玻片，直到草履虫不能游动为止（不可太用力，否则会压破草履虫，并且载玻片与盖玻片乞间间隙太小不利于染色）。取下装片，在盖玻片的一侧滴一滴碱性品红染剂；用吸水纸在盖玻片另一•侧吸收，半染液浸过草履虫，重复一次，间隔lOmin即可置于显微镜下观擦。结果与讨论做好实验记录，包括数据和图片，分析实验结果。