热刺激对原代培养神经元部分生物学特性的影响.doc

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1、热刺激对原代培养神经元部分生物学特性的影响【关键词】神经元【Abstract】AIM:Tostudytheeffectsofhyperthemiaonthemorphologyandapoptosisofneurons,aswe1lasthechangesofneuralvitaiityatdifferenttemperature・METHODS:Themorphologyofneuronswasobservedbymicroscope,theirapoptosiswasdetectedbyKlenowmethodandtheresultswereanalyzedbyimageanaly

2、sissystem・ThevitaiityofneuronswasdetectedbyMTTreductionassay.RESULTS:TheaveragegrayofK1enowpositivece1lsincreasedwithtemperatureandthehighestaveragegraywasl33・40土4.49whi1ethevalueofthecontrolgroupwas69・54土2.70.Thevitaiityofneuronsdecreasedwithtemperature・CONCLUSION:Hyperthemiainducestheapoptosiso

3、fneuronsand39°Cisthetemperaturetoinducethepeakpointofapoptosis・Thevitalityofneuronsdecreaseswiththeincreaseoftemperature・【Keywords】hyperthermia;neuron;K1enowmethod;apoptosis【摘要】目的：研究热刺激对神经元形态及凋亡的影响，观察不同温度下神经元活力的变化•方法:利用倒置相差显微镜观察高温后神经元的形态学改变•应用Klenow法对不同高温后神经元进行凋亡检测，应用图像分析仪对检测的结果进行分析.MTT法进行平均吸光度检测

4、.结果：高温处理后神经元出现形态学改变.Klenow法检测发现未经高温处理的对照组神经元平均灰度为69.54±2.70,高温处理后平均灰度升高，39°C时达高峰133.40±4.49,而后随着温度升高，平均灰度逐渐降低・MTT法测定显示随着温度升高细胞活力逐渐降低•结论：高温处理神经元可诱导其凋亡,39°C时达高峰•神经元细胞活力随温度升高而降低.【关键词】高温；神经元；Klenow法；凋亡0引言热刺激是一种物理致伤因素，常是引起人类中暑、热痉挛、热衰竭等病症的重要因素•其致损伤机制目前尚不清楚•我们采用体外原代培养的神经元，模拟体内梯度高温环境，用倒置相差显微镜、Klenow原位杂交、

5、MTT细胞活力测定技术，研究不同程度高温对体外原代培养神经元形态、活力及凋亡的影响.1材料和方法1.1材料①动物：孕15d昆明种二级孕鼠由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）•②主要试剂和仪器：胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM（Gibco公司），胰酶（华美公司）；DNA聚合酶IKIenow片段介导的dATP生物素切口末端标记试剂盒（Oncogene）；MTT（华美公司）；真彩色图像分析仪（LeicaQ570c）；全自动可调水浴加热器（第四军医大学教保处）.1・2方法1.2.1细胞培养取孕15d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死，消毒后，逐层剖开腹部，取出胎鼠，体视显微镜下分离胎鼠

6、大脑脑泡外侧部的皮质.剪碎脑组织，经125mg・L-l胰酶消化，1000r・：min-l,离心lmin,终止消化，以完全培养基(10mL・L-l胎牛血清，青、链霉素1X1O5U・L-1)稀释至7X108・L-l密度并接种于经多聚赖氨酸处理过，加有玻片的培养皿及96孔板中，送入50mU#12539;L-lC02的培养箱,37.4°C培养48h后，加入阿糖胞昔(10mg・：L-l)以抑制非神经元的继续生长，每隔2d半量换液，培养第7口时，经Ptubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养

7、，进行后续实验[1]•1.2.2热应激损伤模型的建立培养好的神经元移入经乙醇消毒的全口动水浴加热器，处理30min.1.2.3实验分组将培养好的神经元随机分为高温组和对照组①高温组:按高温模型分别于3&39,40,41和42°C温度处理30min.②对照组：37・4°C正常培养的神经元•上述实验及对照组均随机选取3个细胞爬片.1.2.4倒置相差显微镜观察在倒置显微镜下观察处理组及对照组皮质神经元的形态.1.2.5DNA聚合酶IKIe