红树林植物桐花树内生真菌主要无孢类群的分子鉴定.pdf

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1、第３２卷第２期海洋学报Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．２２０１０年３月ＡＣＴＡＯＣＥＡＮＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡＭａｒｃｈ２０１０红树林植物桐花树内生真菌主要无孢类群的分子鉴定邓祖军１，２，曹理想２，陆勇军２，周世宁２（１．广东药学院基础学院，广东广州５１０００６；２．中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州５１０２７５）关键词：内生真菌；桐花树；无孢类群；ＩＴＳ基因；分子鉴定中图分类号：Ｑ９３９．５文献标志码：Ａ文章编号：０２５３４１９３（２０１０）０２０１６１０７生真菌中存在大量的

2、未产孢类群，较难通过传统的１引言分类方法进行鉴定，为更全面地了解桐花树内生真真菌种类繁多，其形态性状复杂多变且易受环菌的类群组成和分布，本研究对桐花树几类主要未境影响，仅依靠形态、生化等表形特征加以鉴别显得产孢真菌类群进行形态分型，并对它们的ＩＴＳ区基较为困难且易出现偏差，尤其是真菌形态鉴定中占因序列进行比较分析，从形态和分子水平对其进行有重要地位的孢子，很多植物内生真菌孢子不能在了进一步的分类和鉴定。一般实验室条件下形成，这一点给分类鉴定带来困２材料与方法难。随着分子生物学技术的发展，基于ＩＴＳ（ｉｎｔｅｒ

3、ｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）区的多态性，ＩＴＳ区的２１材料序列分析近来已广泛应用于真菌种属水平的分类和２１１培养基［１－４］系统发育方面的研究。（１）ＰＤＡ固体培养基：马铃薯２００ｇ，葡萄糖内生真菌（犈狀犱狅狆犺狔狋犻犮犳狌狀犵犻）一般是指共生于２０ｇ，琼脂１５ｇ，５０％人工海水１０００ｍＬ。健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一（２）促孢培养基：ＫＨ，ＫＮＯ，Ｍｇ２ＰＯ４１ｇ３１ｇ类真菌，但在植物衰老或外界刺激条件下，因为植物ＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ＫＣｌ０．５ｇ，淀

4、粉０．２ｇ，葡萄糖［１］自身免疫力下降，也可能会引发某些病症。通常０．２ｇ，蔗糖０．２ｇ，琼脂１５ｇ，水１０００ｍＬ。情况下内生真菌不仅可以促进植物的生长发育，增（３）ＰＤ液体培养基：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，强宿主的抗逆性，还可以产生多种生物活性物质，在５０％人工海水１０００ｍＬ。生物防治和药物先导物开发方面有着重要的应用前２１２植物来源［５－８］景。近年来关于植物内生真菌的研究已成为微在深圳福田红树林自然保护区（２２°３２′Ｎ，生物学研究中的热点。红树林作为热带与亚热带海２的面积内选取５棵成熟的桐

5、１１４°０３′Ｅ）一块０．５ｋｍ区潮间带的重要和特殊的生态系统，对其内生真菌花树（高度大约为１．５～２．０ｍ，它们基本上是处于生物多样性及其代谢产物研究引起了人们广泛的关相同的环境条件下，如潮水冲刷频率、土壤性质、周［９－１３］注。前期工作中我们开展了红树林植物桐花围植被）作为采样的对象。［１３］树———内生真菌的类群分布研究，发现桐花树内收稿日期：２００９０３２４；修订日期：２００９１２２２。基金项目：国家高科技研究与发展（“八六三”）项目（２００７ＡＡ０９Ｚ４４８；２００８ＡＡ０９Ｚ４０２）。作者

6、简介：邓祖军（１９７９—），男，湖南省安仁县人，硕士，讲师，研究方向为植物内生真菌和海洋微生物。Ｅｍａｉｌ：ｄｅｎｇｚｕｊｕｎ６６＠１６３．ｃｏｍ通信作者：周世宁，教授，博士生导师。Ｅｍａｉｌ：ｌｓｓｚｓｌ＠ｚｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ１６２海洋学报３２卷２１３试剂盒及其他主要试剂养基或紫外线照射来诱导孢子产生，如果还不产孢基因组ＤＮＡ提取的试剂盒（Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｆｕｎ子，则根据其菌落及生长特点来分组，对分离株数较ｇａｌＤＮＡＫｉｔ）购自Ｏｍｅｇａ公司；质粒ＤＮＡ提取纯多的组将其命名，如无孢类群Ａ，Ｂ，

7、Ｃ，Ｄ等，数量少化试剂盒购自上海华舜生物公司；ＰＣＲ产物克隆试者统归为其他无孢类群。剂盒（ｐＧＥＭＴｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ）、ＰＣＲ产物纯化试剂盒２２４不产孢类群的分子鉴定购自Ｏｍｅｇａ公司。ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ，ＤＮＡ将分离得到的内生真菌接种到ＰＤ液体培养基Ｍａｒｋｅｒ，Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ，Ｘｇａｌ，ＩＰＴＧ均为ＴａＫａ中，于２８℃摇瓶培养４ｄ。收集菌丝体。用ＯｍｅｇａＲａ公司产品。水饱和酚（ｐＨ８．０）、三氯甲烷、ＢＩＯ公司的真菌基因组提取试剂盒来提取真菌的基因ＷＥＳＴ琼脂糖购自上海

8、生工生物工程技术服务有组。用引物ＩＴＳ１Ｆ（ｆｕｎｇｕｓｓｐｅｃｉｆｉｃ：５′ＣＴＴＧＧＴ限公司。ＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ３′）和ＩＴＳ４（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ：２２方法５′ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３′）扩增真菌２２１植物内生真菌的分离ｒＤＮＡ的间隔序列（含ＩＴＳ１区、５．８Ｓ区、ＩＴＳ２区）［１６］叶、叶脉、茎、树皮（韧皮部）等样品用自来水冲序列。ＰＣＲ反应条件为：９