碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响.pdf

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1、第26卷第2期2017年3月上海海洋大学学报JOURNAL0FSHANGHAIOCEANUNIVERSITYV01．26．No．2Mar一2017文章编号：1674-5566(2017)02旬197旬6DOI：10．12024／jsou．20160601797碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响陈江凤1’2⋯，王广军1，郁二蒙1(1．中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州510380；2．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；3．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)摘要：为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基

2、因表达的影响，利用荧光定量PcR技术，以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组，添加0．024、0．048、O．072、0．096和0．120moL／L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组，对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(A黜一j)、气溶素基因(Ae拍)和弹性蛋白酶基因(n^归)进行相对表达分析。结果表明，5个实验组嗜水气单胞菌的A删一J、Ae甜和。丘归表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加，基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明，添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高，而且随着碳酸氢钠浓度的增加，嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势

3、，表明毒力逐渐减小。关键词：嗜水气单胞菌；碳酸氢钠；致病性；FQ—PCR；毒力因子；基因表达中图分类号：S917文献标志码：A嗜水气单胞菌(Aero脚凡邯^州nDp翮o)是革兰氏阴性菌，隶属气单胞菌科、气单胞菌属。1J。该菌广泛存在于所有的内陆水环境、水底沉积物和水生生物体中，有致病性和非致病性菌株之分。致病性嗜水气单胞菌频繁地威胁到鱼类健康，尤其是在密集投饵的高密度水产养殖中。它是养殖鱼类潜在的致病菌，能引起包括赤皮病、细菌性败血症等鱼类疾病旧J。在我国，此菌曾引起南方各省鲫、草鱼、鲢、鳙等鲤科鱼类爆发败血症，给养殖户带来极大经济损失一3I。嗜水气单胞菌存在多种毒力因子，这些毒力因子与该

4、菌的致病性存在密切关系。已知的毒力因子有溶血素【4J、气溶素¨J、胞外蛋白酶∞J、外膜蛋白"1等。溶血素(A册一j)是嗜水气单胞菌的主要毒力因子之一【8』，能引起幼鼠肠道积液，并通过产生功能性孔洞从而破坏红细胞一J。研究表明，温度、pH等许多因素可影响溶血素基因的表达，从而影响致病菌嗜水气单胞菌的毒力¨⋯。气溶素(Ae一)作为嗜水气单胞菌的主要毒性物质，因存在种属特异性而成为致病性菌株的象征¨1I。研究表明Ae趔缺失株对小鼠的半致死量是野生株的20倍以上¨2I。气溶素具有溶血性、肠毒素毒性以及细胞毒性，抗胰酶，不耐热¨3

5、。气溶素与红细胞表面的特定糖蛋白受体结合，通过聚合作用形成毒素六聚体

6、，插入到红细胞的脂质双分子层中，形成孔洞，增强细胞膜渗透性，导致细胞破裂死亡¨4

7、。弹性蛋白酶(8是徊)是嗜水气单胞菌的重要毒力因子，能够水解弹性蛋白，且与其他的金属蛋白酶具有高度的序列相似性，Ⅱ矗徊突变株的半致死量比野生株高100倍以上㈣。在一定条件下，碳酸氢钠能抑制细菌生长¨6

8、，已有研究表明碳酸氢钠对大肠杆菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌等病原菌有抑制作用¨6。17I。前期实验证明碳酸氢钠达到特定浓度后能有效抑制嗜水气单胞菌生长。在水产养殖生产中，碳酸氢钠被用做治疗某些细菌性疾病的辅助药物¨8

9、，这除了与致病菌生长有关，是否收稿日期：2016一06—06修回日期：2016．10一

10、10基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD25801)；广东省海洋渔业科技推广专项(B201400c01)；中国水产科学研究院基本科研业务费专项(2016HY-zD0703)；国家现代农业产业技术体系建设专项(cARs46一17)作者简介：陈江风(1990一)，女，硕士研究生，研究方向为水产动物健康养殖。E—mail：cj岔142@163．com通信作者：王广军，E—mail：西wang@p商．ac．cn198上海海洋大学学报26卷还与其毒性相关?其主要毒力相关的基因表达有何变化?为探究碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响，本实验用不同浓度的碳酸氢钠培养嗜水气单胞菌，采用荧光定

11、量PcR技术对嗜水气单胞菌编码溶血素、气溶素、弹性蛋白酶等3种主要毒力因子的基因进行相对表达分析，以期能初步了解碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力因子的影响规律。1材料与方法1．1实验材料1．1．1菌株及其复壮嗜水气单胞菌(菌株编号：ATCC7966)来源于ATcC。菌株接种于LB培养基，28℃、200r／min培养24h，再接种到绵羊血平板培养基复壮，28℃培养24h后挑选溶血圈大的单个菌落接种于LB培养基，培养24h接种到1