酶工程(酶制剂制备).ppt

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1、CH4酶制剂的制备和精制尽管发酵微生物的种类不同，有的是以胞内酶为主，有的以胞外酶为主，无论哪一种，最终得把它们提取出来，并使其达到一定的纯度，这就是酶制剂的制备和精制的任务。目前我国生产的工业酶制剂，普遍纯度较低，就丹麦NOVO公司生产的酶制剂的纯度远远高于我国的产品。如果胶酶（Pectinases),NOVO公司生产的酶制剂的比酶活力较我国最好的产品高5—10倍，尽管酶制剂的价格较高，但其在生产上应用成本还低于我国的产品。——（细胞破碎）——发酵液预处理——酶液脱色——酶蛋白的初步纯化与浓缩——（酶蛋白的提纯与精制）——酶制剂的成形。CH4.1酶制剂的工

2、业提取方法CH4.1酶制剂的工业提取方法1细胞破碎方法对于胞内酶的提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内的酶蛋白游离出来，常用的破碎方法有以下几种：1.1机械破碎法：1.2物理破碎法：1.3化学方法：①机械捣碎法：10000转/分。②研磨法：只适合于实验室的小规模操作。③匀浆法：细胞的破碎程度较高，规模小。①温差破碎法：②超声波（>20kHz）裂解法：15-25kHz，100-150W，0-10℃，3-10min；目前有效的化学方法主要是加入表面活性剂法常用的有：特里顿X-100和吐温（Tween），其主要是破坏细胞膜的结构，增加膜通透性。此法在实验室

3、和生产上已成功应用CH4.1酶制剂的工业提取方法2发酵液的预处理2.1发酵液絮凝发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌体自溶产生的细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，使得发酵液很难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。发酵液的预处理的常用方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，常用的絮凝剂有：聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（PolystyreneSulfonate）；絮凝剂加入，主要有以下三方面的作用：①改变发酵液中悬浮粒子的物理特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；②使一些可溶性的胶体物质变成不溶性的沉淀粒子；③降低发酵液的黏度。2.2酶

4、液的脱色这一步骤可根据酶制剂的要求而定，一般工业酶制剂允许含有来源中的色素，所以就不脱色；对于医用酶制剂、分析用酶等必须进行脱色处理；目前大部分工业酶制剂都要进行脱色处理过程。常用的脱色剂有活性炭和离子交换树脂。活性炭吸附法，操作效率较高，脱色较彻底，但在脱色的同时，也有部分酶蛋白被吸附掉了；离子交换树脂基本上在脱色的同时，不吸附酶蛋白。我国生产了一种脱色专用树脂：通用１号脱色树脂。在弱酸性条件下，其吸附色素，而在碱性条件下便释放色素。树脂的再生方便，再生的条件是：先用５％的NaOH洗脱色素，待色素洗脱干净后，用蒸馏水洗到中性，再用5%的HCl（二倍树脂床体

5、积）中和树脂，再用蒸馏水洗到pH5.0-5.5为止。CH4.1酶制剂的工业提取方法3酶蛋白的初步纯化与浓缩3.1盐析法[1]盐析的基本原理：蛋白质在水中的溶解度与其所带净电荷的多少呈正相关，即蛋白质的极性越强，其溶解度越大，溶液中的离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质的水合程度，降低其溶解度；另一方面，液相中离子的电荷部分地中和蛋白质分子上的电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出；此外，溶液中的盐离子引起水分子的极化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。在盐溶液里，蛋白质的溶解度的对数值与溶液里的离子强度成线性关

6、系，人们总结了以下经验公式：logS=β-Ks.μS:Protein的溶解度g/l；β为溶液离子强度为零时的logS，β值受蛋白质性质、盐离子的种类、溶液的温度和pH值的影响；Ks为盐析常数，因蛋白质而性质和盐离子的种类不同而不同；μ为溶液的离子强度。[2]盐析的基本方法：蛋白质的盐析方法主要有以下两种：Ks盐析法：即蛋白质溶液的pH值和温度固定不变，改变溶液的盐浓度（离子强度），以达到沉淀蛋白的作用；此法常用的盐是硫酸铵。β盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的pH值和温度，以达到蛋白沉淀的目的。在实际工作中，常用的是Ks盐析法，利用不同饱和度的(NH4

7、)2SO4浓度，这样不同的蛋白质析出沉淀的(NH4)2SO4浓度不同；通过这种方法可将部分杂蛋白分离出去，达到浓缩酶蛋白的目的。[3]盐析曲线：按盐析经验公式，以中性盐浓度对酶蛋白溶解度作图，得一条如下曲线：盐浓度（饱和度）酶蛋白溶解度盐溶效应：[4]具体操作方法：饱和溶液法:干粉加入法:[5]影响盐析的因素：温度：pH：[6]盐析后的脱盐处理透析法：凝胶过滤法：CH4.1酶制剂的工业提取方法3酶蛋白的初步纯化与浓缩3.2有机溶剂沉淀法除用盐析法沉淀酶蛋白外，还可以用有机溶剂沉淀酶蛋白，目前选用的有机溶剂主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的

8、价格高，蒸馏回收困难，所以目前多采用乙醇作沉淀剂。沉