流式细胞术检测脂多糖对罗氏沼虾血细胞活性和免疫功能的影响.pdf

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1、第33卷第1期2011年1月海洋学报ACTA0CEANoLOGICASINICAV01．33。No．1January20l1流式细胞术检测脂多糖对罗氏沼虾血细胞活性和免疫功能的影响冼健安1’2，王安利1’弘，苗玉涛h2，伍娟1’2(1．华南师范大学生命科学学院广东省水产健康安全养殖广东省重点实验室，广东广州市510631；2．华南师范大学生命科学院生态与环境科学广东省高等学校重点实验室，广东广州510631)关键词：脂多糖；罗氏沼虾；血细胞；免疫反应；流式细胞术中图分类号：Q952．5文献标志码：A‘文章编号：0253—4193(2011)

2、01—0170—081引言中的应用打下一定的基础。革兰氏阴性菌是虾类的一大致病菌，深入了解虾类对革兰氏阴性菌的免疫防御机制以及革兰氏阴性菌对虾类的致病机理，对虾类健康养殖有着重要的科学和实践意义。脂多糖(tipopolysac-charide，LPS)，即内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，具有很强的抗原性和毒性[1-2]。甲壳动物的非特异性免疫机制能够识别LPS为非己物质，并作出一系列的免疫应答反应，即LPS能诱导提高机体的非特异性免疫能力[2]，因此LPS也常作为免疫刺激剂添加到饵料中，以达到增强虾体的抵抗力、

3、改善养殖效果的目的，但对其作用的具体机制尚不明确。本研究把罗氏沼虾血细胞在离体外添加LPS刺激，在不同的处理时间取样检测其活性和功能的变化，以进一步研究LPS对虾类非特异性免疫功能的影响，探讨虾类对抗病原菌的免疫机制，为LPS作为免疫多糖的添加使用提供一定的依据，并为流式细胞术在甲壳动物血细胞免疫功能研究2材料和方法2．1材料罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)购于广州黄沙水产品交易市场，体长为10～14cm，在实验室暂养5d后，选取附肢完整、无病患、活力强的个体作为实验用虾。碘化丙啶(propidiumiodide

4、，PI)、黄绿色人工荧光微球(直径1ttm)、2’，7’一二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH—DA)、LPS(Esche—richiacoli)均购自美国Sigma公司。2．2血细胞样品的制备用1mL一次性注射器吸取200弘I。预冷的虾血抗凝剂(450mmol／dm3NaCl，10mmol／dm3KCl，10mmol／dm3HEPES，10mmol／dm3EDTA—Na2，pH7．3)，然后从虾的围心腔抽取200弘I。血淋巴。取足量的血淋巴后将其混合、离心(800×g，4℃，10min)，弃去上清液后加等量的虾生理盐水[-450mmol／dm

5、sNaCl。10mmol／dmsKCl，10mmol／dm3HEPES，pH7．3，虾盐溶液(shrimpsaltsolution，收稿日期：2009—04-19；修订日期：2010一l卜19。基金项目：国家自然科学基金资助项目(30671628)；广东省教育部产学研结合资助项目(20061)90204005)；国家科技支撑计划项目(2007BAD29806)}广东省科技计划项目(20078020708013)；广东省重点科技项目(2009A020101006)；广州市科技支撑计划项目(200921一E681)。作者简介：冼健安(1983一

6、)，男，广东省鹤山市人，博叶=研究生，研究方向为水生动物营养免疫学。E-mail：xian-ja@163．corD．*通信作者：王安利(1957一)，男，河北省滦南县人，教授，博上生导师，从事水生动物营养免疫学和健康养殖生态学的教学和研究。E～mail：wanganl@SCnLI．edu．cn1期冼健安等：流式细胞术检测脂多糖对罗氏沼虾血细胞活性和免疫功能的影响171sss)3重悬细胞，用10mL离心管分装为7管，每管6mL。2．3脂多糖处理7管中在其中6管血细胞悬液分别添加以下试剂进行处理：3个浓度的i．PS(1，3和5ttg／cm3)，

7、同时添加3ttg／cm3LPS和100ttg／cm3胰蛋白酶抑制剂(trypsininhibitor，TI)(LPS+TI组)，只添加Tl(T1组)、不添加任何物质处理的血细胞悬液作为空白对照组。余下1管分为两份用作酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活力检测的阳性对照，一份同时添加3ttg／cm3LPS和3(g／cm3胰蛋白酶(LPS+T组)，另一份只添加胰蛋白酶(T组)。将细胞悬浮液置于室温孵育，于一定的时间取样检测。实验重复3次。2．4流式细胞仪分析实验所用流式细胞仪是美国BD(BectonDick—inson)公司生产的FA

8、CSCalibur，应用CellQuest软件(BectonDickinsonImmuno—cytometrySystems，SanJose，CA)进行实验数据的获取和分析。每个