苹果est—ssr引物开发和部分品种亲缘关系研究

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1、苹果EST—SSR引物开发和部分品种亲缘关系研究　　摘要：【目的】开发苹果EST-SSR引物，评价苹果种质资源的多样性与亲缘关系。【方法】利用NCBI数据库中苹果EST的SSR位点开发了35对EST-SSR引物，建立了苹果EST-SSR体系，并利用筛选出的16对引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究。【结果】118份基因组DNA共扩增出等位基因位点138个，位点数的变化从3到13不等，平均每对引物检测到8.62个位点，总的多态性比率为94.2%，各引物的多态性比例分布为81.8%～100%，相似系数为0.

2、48～1.00。利用UPGMA法构建聚类树状图，在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为5大组：其中第1组又可分为2个亚组，包含了绝大部分供试材料；第2、3、4和5组包含的品种数目分别为12个、11个、3个和2个；第5组与其他组亲缘关系较远，相似性系数仅为0.48。【结论】筛选出的16对EST-SSR引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。关键词：苹果；EST-SSR引物；亲缘关系；聚类分析；相似性系数中图分类号：S661.1文献标志码：A文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-050

3、9-0714苹果属（MalusMill.）植物种类繁多，分布广泛，多具有较高的经济价值。之前，分类学家从形态学、细胞学、孢粉学、同工酶等方面对苹果的亲缘演化关系进行研究并取得一定进展[1-3]。但传统方法对于差异不明显的形态有时难以识别，一些特征易受生态环境的影响，SSR标记多态性丰富、稳定性突出，在苹果及近缘种质鉴别与亲缘关系研究中也已得到应用[4-6]。但开发SSR标记过程繁琐，成本较高，是其应用的主要限制因素[7]。EST-SSR标记具有开发效率高、成本低的特点，是SSR标记的重要来源[8]，因其

4、来自基因编码区，更易获得基因表达的信息，目前已经应用在葡萄[9]、甘蔗[10]、小麦[11]、大麦[12]、大豆[13]、水稻[14]等物种的遗传多样性分析、遗传图谱构建和系统演化研究等领域。近年来，随着苹果属EST库数据资源不断丰富，开发EST-SSR标记已具备了基础，姚利华等[15]用开发出的12对EST-SSR引物对20个苹果品种的多样性进行了检测，Gasic等[16]对苹果EST-SSR在其他蔷薇科植物上的应用进行了研究。我们拟利用数据库资源开发新的EST-SSR标记，对118份苹果种质进行亲缘

5、关系分析，以丰富该类标记资源，并对育种中品种资源的评估、筛选与利用提供参考。1材料和方法1.1材料141.2方法1.2.1EST-SSR序列的查找利用SSR鉴定软件与网站在线搜索工具，从GDR（http：//www.bioinfo.WSU.edu/gdr/）中搜索苹果属含有SSR的EST序列，并进行可利用性筛选，筛选序列长度不小于100bp且不大于700bp以及单至六碱基重复单元的重复次数至少为10，6，5，5，5和5的标准[9]。1.2.2EST-SSR引物对的设计应用引物设计软件PrimerPrem

6、ier5.0对符合条件的部分EST-SSR序列进行引物设计。设计EST-SSR引物的原则和参数为：避免二级结构；引物长度一般控制在18～22bp；GC含量在40%～60%；理论退火温度（Tm）在55～60℃，且上下游引物Tm值相差不超过5℃；产物长度控制在100～350bp，以更加有效地扩增目标SSR。引物委托上海生物工程技术服务有限公司合成。1.2.3基因组DNA提取及检测采用改良的CTAB法[17]提取苹果叶片总DNA。获得的DNA经紫外分光光度计检测OD260/OD280比值；用0.8%的琼脂糖凝

7、胶电泳检测DNA纯度。将合格的基因组DNA原液稀释到20mg·L-1于-20℃条件下保存备用。1.2.4SSR-PCR扩增PCR扩增在PTC-200PCR仪上进行。通过优化确定了稳定的苹果EST-SSR反应体系，即在2514μL体系中，MgCl2浓度为2.0mmol·L-1，dNTPs浓度为0.3mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量为1.0U，DNA模板用量为1.5mg·L-1，引物浓度为0.4μmol·L-1。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min

8、，进行30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。1.2.5扩增产物检测及数据统计分析从供试材料随机选取部分品种基因组DNA样品，用不同引物在上述反应体系中将其扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后以条带的多态性和稳定性为标准进行筛选。以选出的引物对各供试材料进行扩增，参照Bassam等[18]的银染检测方法进行检测。凝胶上相同迁移率的条带假定来自同一等位基因，每个反应独立进行2次，不统计不稳定的条带或弱带。每对EST-SSR引物检测1个位点，电泳图谱