实验五培养细胞的形态观察和计数.ppt

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1、实验五培养细胞的形态观察和计数实验目的了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。实验用品一、材料和标本培养中的几种细胞。二、器材和仪器倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管。三、试剂0.3%台盼兰染液等实验内容一、培养细胞的形态观察(一)原理体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞,如内皮细胞,叫贴壁型细胞。体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞-并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL-60,叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血

2、液原性或癌原性的细胞。(二)操作1.从培养箱中取出细胞培养瓶,注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。2.打开倒置镜光源,通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。3.调节载物台的高度进行对焦,在看到细胞层之后,再用细调节器将物像调清楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10×物镜。（三）结果贴壁细胞一般有两种形状,即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片,如HeLa细

3、胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有圆核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起,细胞群常借原生质突连接成网,如NIH3T3。贴壁细胞在生长状态良好时,细胞内颗粒少,看不到有空泡,细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培养液清澈透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多时,表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌或真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚,透明发亮时,生长较好；反之,则较差或已死亡。由于培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表

4、明细胞的生长状态。呈橙黄色，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时,则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多；如呈紫红色,则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、pH、生长周期而改变,但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中,镜下折光率高,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定（一）原理细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度,是进行实验必不可少的一种基本技能。（

5、二）操作1.将培养瓶中的培养液倒人干净试管中,向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1.0m1,静置3～5分钟,待见到细胞变圆,彼此不连接为止。2.将试管中的培养液倒回培养瓶中,并轻轻进行吹打,制成细胞悬液。3.取细胞悬液0.5m1,加入0.3%台盼兰染液0.5ml时,混合后染色3～5分钟。4.滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上,使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加。在普通光镜10×物镜下计数四个大格内(如图1，2示)的细胞数,

6、压线者数上不数下,数左不数右。（三）结果细胞浓度计数4大格细胞总数×104×稀释倍数/4=细胞数／ml（4大格中细胞总数－染色细胞）×104×稀释倍数/4=活细胞数／ml悬液注①4大格中的每一大格体积为0.lmm3。1ml＝10000大格，因此，1大格细胞数×104＝细胞数／ml。注②染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上兰色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。作业1.总结培养细胞生长观察方法。2.将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出

7、来。