RP-HPLC法测定大鼠血浆中维生素D3的研究.pdf

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1、第２期总第２６０期农业科技与装备Ｎｏ．２ＴｏｔａｌＮｏ．２６０２０１６年２月ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＥｑｕｉｐｍｅｎｔＦｅｂ．２０１６RP-HPLC法测定大鼠血浆中维生素D３的研究*冯欢欢，张一凡，任雪，徐彩红（沈阳师范大学粮食学院食品系，沈阳１１００３４）摘要：建立一种维生素D3（ＶD3）在大鼠体内浓度的测定方法，为食品中营养素的生物利用研究奠定基础。采用RP-HPLC法进行检测分析；采用甲醇沉淀蛋白结合乙醚液液萃取法进行血浆样品处理。结果表明：低、中、高3个浓度ＶD3的提取回收率分别为8

2、7.8％±5.14％，85.4％±3.00％和89.6％±5.71％；日内、日间的精密度分别小于5.12％和6.30％。该方法灵敏度高、稳定性好，可作为食品、药学研究中大鼠体内吸收动力学相关试验研究的检测分析方法。关键词：高效液相色谱法；25-羟基维生素D3；大鼠血浆中图分类号：R446.1文献标识码：A文章编号：1674-1161（2016）02-0047-03维生素D（ＶitaminD，ＶD）是一种脂溶性维生素，可调波长紫外检测器和工作站：美国Agilent公司；见光极易分解，其作用主要是调节人体内钙和磷的代AvantiJ-E离

3、心机：ＢECＫMANCOULTER公司。［1-2］谢，促进其吸收利用，促进骨骼成长。ＶD的主要活１.４试验方法性形式有25-羟基维生素D3［25（OH）ＶD3］，1，25-二１．４．１色谱条件色谱柱：ODSHＹPERSILC18色谱柱羟基维生素D3［1，25（OH）2ＶD3］和24，25-二羟基维（200.0mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇—水（98∶2，生素D3［24，25（OH）2ＶD3］3种。其中25（OH）ＶD3为Ｖ／Ｖ）；柱温：35℃；流速：1.0mL／min；检测波长：265血液中ＶD的主要循环形式，是显示ＶD状

4、况的一个nm；进样量：20μL；仪器灵敏度：0.001AUＦS。［3］最佳指标，但其在血清中浓度相当低，一般检测方１．４．２血浆样品处理精密量取大鼠血浆100μL，置［4-5］法无法检出。为此，本课题参考相关文献，建立一10mL具塞离心试管中，加入甲醇200μL，涡旋混合种利用高效液相色谱法检测维生素D3（ＶD3）的方法。1min，加入无水乙醚2.0mL，涡旋3min，6000r／min１材料与方法离心5min，吸取有机层1.5mL置另一5mL试管中，１.１试剂残液中再加入无水乙醚2.0mL。重复上述提取过程，维生素D3（ＶD3，纯

5、度99.9％）：中国食品药品检合并两次提取液，于40℃水浴中氮气吹干。残留物用定研究院；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：上海永日药100μL流动相溶解，涡旋振荡3min，将溶液转移至品贸易有限公司；甲醇（色谱纯）：山东禹王化工制品1.5mLEP离心试管中，12000r／min离心10min，取有限公司；无水乙醚（分析纯）：天津凯信化工制品有上清液20μL进样，记录药物峰面积，并代入当天制限公司；其他试剂均为分析纯；水为自制二蒸水。备的标准曲线中，计算血浆中药物浓度。１.２供试动物２结果与分析雄性Wistar大鼠，体质量220±30g

6、，由沈阳药科２.１色谱行为大学实验动物中心提供。在本试验所采用的色谱条件和血样处理方法下，１.３仪器设备大鼠空白血浆色谱图见图1中A；一定浓度的ＶD3溶1200系列高效液相色谱仪，包括1200泵系统和液加入空白血浆中的色谱图见图1中Ｂ，ＶD3的保留时间为8.165min；大鼠给药后某时间点的血浆样品收稿日期：2015-10-17色谱图见图1中C。结果表明：血浆中的内源性物质作者简介：冯欢欢（１９９４—），女，从事食品营养素检测与分析方面的研究工作。不干扰血浆中药物浓度测定。药物色谱峰的理论板数通信作者：徐彩红（１９７９—），女，博士

7、，讲师，从事营养素组分均不低于2000，药物与杂质峰的分离度大于2.0。间的相互作用方面的研究工作。48农业科技与装备２０１６年２月ＶD3低、中、高3个浓度下的提取回收率均高于80％。表１大鼠血浆中ＶD３测定方法的准确度和精密度（ｎ＝６）Tａｂlｅ1AｃｃｕｒａｃｙａndpｒｅｃiｓionoｆＶＤ３dｅｔｅｒｍinａｔionｍｅｔhodinｒａｔｓplａｓｍａ（ｎ＝６）日内日间ＶD3浓度／χ±S.D.／χ±S.D.／（μg／mL）RSD／％RSD／％（μg／mL）（μg／mL）A0.400.40±0.0163.930.37±0.02

8、36.301.001.03±0.0525.120.98±0.0575.832.002.00±0.0371.861.94±0.0392.02表２大鼠血浆中ＶD３的提取回收率（ｎ＝６）Tａｂlｅ２Ｅｘｔｒａｃｔionｒｅｃoｖｅｒｙｒａｔ