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1、第48卷第4期厦门大学学报(自然科学版)Vol.48No.42009年7月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Jul.2009L2半胱氨酸作为化妆品美白添加剂的作用机理3杨美花,李智聪,刘凤娇,庄江兴,王勤,陈清西(厦门大学生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建厦门361005)摘要:酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是黑色素形成的关键酶,其抑制剂的研究是当前美白添加剂研究的热点.研究了L2半胱氨酸(L2Cys)对蘑菇酪氨酸酶和小鼠B16黑色素瘤
2、细胞粗提的酪氨酸酶的抑制效应,实验结果表明,L2Cys对2种来源的酪氨酸酶有较强的抑制作用,其半效抑制浓度分别为1.75,15μmol/L.对小鼠B16黑色素瘤细胞粗提的酪氨酸酶的抑制主要表现为显著延长酶促反应的迟滞时间,同时显著降低酶的活力.进一步对L2Cys在细胞毒性方面进行了研究,结果表明,在200μmol/L浓度下,L2Cys对小鼠黑素瘤细胞B16的生长未显示出明显影响,对细胞状态、代谢MTT的能力、细胞增殖率等均无影响,无明显细胞毒性,是一种有潜力的增白剂,为L2Cys作为美白添加剂提供了依据.关键词:
3、L2半胱氨酸;黑色素;酪氨酸酶;B16黑色素瘤细胞中图分类号:Q356.1文献标识码:A文章编号:043820479(2009)0420581204黑色素是在黑素小体内合成的一类具有复杂结1.1材料构、非均质的类多酚聚合体,其量的多少以及分布决定[1]小鼠B16黑色素瘤细胞购自CTCC;RPMI1640着肤色的深浅,其代谢失调会导致色素沉着性疾病.培养基、胎牛血清购自Gibco公司;双抗(10000U/哺乳动物体内,酪氨酸酶首先催化L2酪氨酸羟化成为mL青霉素、10000μg/mL链霉素)、32(4,52二甲基噻
4、L多巴(L2DOPA),并进一步催化L2DOPA氧化生成唑22)22,52二苯基四氮唑溴盐(MTT)、胰酶、L2DOPA多巴醌,再经过多步酶促和非酶促反应,最终生成黑色与蘑菇酪氨酸酶均购自SigmaAldrich公司;L2Cys购素.酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成的关键酶,决定黑自奥伯生物试剂公司.其余试剂均为国产分析纯.[1]色素合成的速率.当前化妆品市场上的美白产品的主要添加剂如曲酸及其衍生物、熊果甙、抗坏血酸及其1.2方法衍生物、维生素E、绿茶提取物、甘草提取物等,均是通1.2.1L2Cys对蘑菇酪氨酸酶催化
5、L2DOPA氧化反过抑制酪氨酸酶的活性从而抑制黑色素合成,达到美应吸收光谱的影响[2-4]白的效果.因此,寻找安全、高效的酪氨酸酶抑制采用文献[6]的测活体系,在含有0.5mmol/LL2剂成为化妆品添加剂研究的热点.DOPA,3.33μg/mL酪氨酸酶,0.05mol/L磷酸缓冲L2半胱氨酸(L2Cys)是一种含有巯基的天然氨基液(pH6.8)的反应体系中,加入不同浓度的L2Cys,酸,作为改性剂广泛应用于食品加工领域.近年来,L230℃下监测酶催化L2DOPA氧化过程吸收光谱的变Cys作为抗氧剂,在果蔬保鲜领
6、域也有较多研究[5],但化情况,波长为230～800nm.是L2Cys作为美白化妆品添加剂的作用机理尚未见1.2.2L2Cys对蘑菇酪氨酸酶活力的影响报道.本文研究了其对黑色素合成的关键酶———酪氨参考文献[6],以L2DOPA为底物,在含不同浓度酸酶活力的影响,并对其作为化妆品美白添加剂的可L2Cys的测活体系中,30℃下分光光度计监测波长为能性进行了研究.475nm处的光密度值的变化,反应时间为3min,计算酶的活力.1材料与方法1.2.3小鼠B16细胞酪氨酸酶粗提液的制备小鼠B16细胞用完全培养基培养(RP
7、MI1640,含10%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100U/[7]mL).细胞裂解方法按照分子克隆介绍的方法,并略收稿日期:2008210231做修改.小鼠B16细胞在37℃、5%CO2下培养48h,基金项目:福建省重点科技计划项目(2007N0051),福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目资助至细胞接近融合状态,37℃下用胰酶消化5min,收集3通讯作者:chenqx@xmu.edu.cn细胞,采用裂解缓冲液(0.25mol/LTris2HCl,pH·582·厦门大学学报(自然科学版)2009年5
8、7.8)对细胞重悬并计数,调整细胞浓度至约2×10/mL,置液氮中速冻1min后置37℃解冻,反复冻融5次裂解细胞,15000r/min离心10min,上清即为小鼠B16细胞酪氨酸粗提酶液.1.2.4L2Cys对小鼠B16细胞酪氨酸酶活力的影响B16细胞粗提液酪氨酸酶活性测定采用96孔酶标板测定,在100μL体系(含0.4mg/LL2DOPA和不同浓度的L2Cys,及恒定
