DB34∕T 1938-2013 鸭黄病毒感染诊断技术规程.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T1938—2013鸭黄病毒感染诊断技术规程TechnicalregulationforDiagnosisofduckflavivirusinfection2013-08-28发布2013-09-28实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1938—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业委员会提出。本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、扬州大学兽医学院、安徽省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：王桂军、朱良强、耿照玉、魏建忠、占松鹤、潘玲、汪彤、何长生、江定丰、杨德康、栗新、吴葆谊。ID

2、B34/T1938—2013鸭黄病毒感染诊断技术规程1范围本标准规定了鸭黄病毒感染临床诊断和PCR检测的技术规程，其中包括流行病学、临床诊断、实验室诊断以及试验材料、操作程序及结果判定。本标准适用于临床鸭黄病毒感染的诊断和检测，PCR检测适用于病鸭卵巢、输卵管、胰腺、脑等组织的鸭黄病毒的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1鸭黄病毒（duckflavivirus)鸭黄病毒，又称鸭坦布苏病毒，属于黄病毒科。2010年以来，我国安徽、福建、山东、浙江、江苏等地的蛋鸭和种鸭由于鸭黄病毒感染而引起产蛋量骤然减少，给我国养鸭业造成重大经济损失。2.2聚合酶链式反应（polymerasech

3、ainreaction，PCR）PCR技术是一种在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，经过多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。2.3引物（primer）根据鸭黄病毒NS1基因设计一对特异性引物：——上游引物R1：5'-CGCGGATCCTCTGGGAACGACGAGAAG-3'——下游引物R2：5'-CCGGAATTCTCGGCATTGACATTTACT-3'3仪器PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。4临床诊断4.1发病日龄1DB34/T1938—2013鸭黄病毒易感

4、染通常发生于25～40周龄的产蛋种鸭、蛋鸭。4.2流行特点该病一年四季均可发生。病鸭开始出现采食量减少和产蛋量下降。产蛋率从产蛋高峰下降到10％以下，种蛋受精率降低10％左右。病鸭产蛋多为畸形蛋和软壳蛋，病死率0～15％。没有继发感染情况下，病程持续10～30d，鸭群会自然康复，产蛋率也随之恢复，但一般最多可恢复到发病前的70％。4.3临床症状感染鸭黄病毒的鸭表现为发热、精神萎靡、站立不稳、共济失调、拉草绿色稀便、双腿瘫痪、向后或侧面伸展。产蛋期间鸭感染鸭黄病毒表现产蛋下降，后备母鸭开产前感染鸭黄病毒可致开产推迟。人工感染雏鸭最早可在20日龄左右发病，以神经症状为主，表现站立不稳、倒地不起、行

5、走不稳，病鸭有饮、食欲，但多数因饮水、采食困难衰竭而死，死淘率一般在10％～30％。4.4剖检病变剖检病死鸭，可见典型病理变化有：发病鸭解剖可见肝脏肿大，脂肪肝变性严重，表面有出血斑,脾脏肿大斑驳呈大理石样；胰腺有出血和坏死；卵泡变性、畸形、坏死或液化，卵泡膜充血、出血、萎缩等症状。公鸭可见睾丸体积缩小，重量减轻，输精管萎缩。5RT-PCR检测5.1采样无菌采集上述临床诊断为鸭黄病毒感染疑似病鸭的卵巢、输卵管、胰腺和脑组织。5.2样品的处理在10℃以下进行样品处理。用无菌PBS缓冲液与样品按体积质量比5:1将样品研磨匀浆。将样品匀浆放置于-20℃中冷冻，再室温融解，反复三次。5.3RNA抽提在

6、含有样品的塑料离心管中加入600μL抽提液A（1mol/LTris水溶液饱和酚:三氯甲烷:异戊醇按照25:24:1的混合液），用力混合至少30s,12000r/min离心5min,小心取上层水相(约800μL)，再加入700μL抽提液B(三氯甲烷/异戊醇按24:1的比例混合液)，用力混合至少30s,12000r/min离心5min，小心取上层水相(约600μL)。再加入-20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醉(约900μL)，倒置数次混匀后。12000r/min离心30min，小心弃去上清。干澡后加10μL水溶解，用作模板。5.4变性和退火在PCR管中加入10μL模板和2.5μL引物R2，加2.5

7、μL水使总体积为15μL,置于70℃反应5min。立即冰浴2min，低速离心约5s。5.5cDNA合成2DB34/T1938—2013在上述反应管中继续加入5μL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液,2.5mmoldNTPs2μL,O.5μLRNA酶抑制剂(20U),1μL逆转录酶M-MLV(10U)和1.5μL水。37℃水浴1h，合成cDNA链。完成后进行下一步反应。5.6PCR扩增DNAPCR为50μL体