南农 生物分离工程 双水相萃取课件.ppt

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1、双水相萃取技术AqueousTwo-PhaseExtractionATPS基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，产品的活性和功能对环境因素特别敏感。传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。发展历史1896年Beijeronck将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象1956年Albertsson分离叶绿体,开创了双水相萃取技术,解决了蛋白质变性和沉淀的问题。1979年德国的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离建立ATPS的相图研究蛋白质、核酸

2、、病毒、细胞、细菌、海藻、叶绿体和线粒体等在ATPS中的分配系数2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系双水相的形成聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，PEG=聚乙二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸钾DX=葡聚糖(dextran)双水相的形成Phase1:4%polyeth

3、yleneglycolinwaterPhase2:4%dextraninwaterDr=0.2g/ccs=1.2dyne/cmPEGDextran双水相的形成PhaselégèrePhaselourdeDextran(%)Monoph.PEG%类　　型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵各种类型的双水相

4、体系a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点PEG/Dx系统的相图PEG/KPi系统的相图PEG6000，Dex的相对分子质量如下：1.D5(Mn2800，Mr3400)2.D17(Mn23000，Mr30000)3.D24(Mn23000)4.D37(Mn88000，Mr179000)5.D43(Mn180000，Mr460000)6.D170(Mn630000，Mr2200000)Mn—数均分子量Mr—重均分子量PEG／Dex体系的双节线和临界点双水相萃取的原理利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法溶质在双水

5、相中的分配系数用m=c2/c1表示。c1和c2分别表示平衡状态下相和上相中溶质的总浓度。双水相萃取的原理一般而言，离子性大的蛋白质会出现在下层盐相，而疏水性较大的蛋白质则在上层聚合物相各种细胞，噬菌体的分配系数一般大于100，或小于0.01;蛋白质(如酶)的分配系数在0.1-10之间，无机盐的分配系数一般近于1.0分配系数的差异，构成了双水相萃取分离物质的基础。双水相萃取的原理生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，主要有静电作用疏水作用生物亲和作用分配系数是各种相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，m

6、l分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。1．静电作用非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，BrΦnsted方程推导下述分配系数表达式：Lnm=-Mλ/RTm-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和成相系统有关的常数;R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间呈线性关系20世纪90年代发现ATPE也可用于提取生物小分子抗生素氨基酸天然物3.02.01.00.10.05012345678胰岛素溶菌酶胰蛋白酶a凝乳蛋白酶卵白蛋白a–淀粉酶牛血清白蛋白铁传递蛋白Pr

7、oteinMolecularWeight(X10-4Daltons)m(PEGphase/Dextranphase)PEG6000-Dextran500DistributionCoefficient实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，在两相间产生电位差，分配系数表达式为lnm=lnmo+ΔφFZ/RT荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异2．疏水作用疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统疏水性的影响。有必要确定双水相系统的疏水性尺度PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG

8、相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF(hydrophoblcfactor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa