氨基酸及蛋白质的分离.ppt

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1、氨基酸混合物的分析分离氨基酸的分析分离工作是测定蛋白质结构的基础，分离和定量测定蛋白质水解液中的各种氨基酸是一项艰巨的任务。层析是利用混合物中各组分的理化性质的差别，使各组分以不同程度分配在两相（固定相和流动相）中，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。分配层析的一般原理层析即色层分析又称“色谱”(chromatograghy）。固定相(静相):固相/液相/固-液混合相流动相(动相):液相/气相Kd=CA/CB其中:Kd---------分配系数CA--------某物质在A相(动相)中的浓度CB--

2、------某物质在B相(静相)中的浓度一般混合物中各成分的分配系数差异越大,越容易分离。层析系统A.逆流分溶（逆流分配）Kd=1Kd=3B分配柱层析纤维素、淀粉、硅胶等茚三酮显色定量C.纸层析：常用于氨基酸混合物的分离、鉴定单向纸层析图Rf值双向纸层析图D薄层层析纤维素粉、硅胶、氧化铝等E.离子交换层析原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应。由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达

3、到分离的目的。这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-氨基酸分析仪图解光源波长440和540nm反应螺旋管茚三酮光电倍增管记录仪茚三酮泵已分开的氨基酸离子交换柱洗脱剂缓冲液泵样品注入口分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂。在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间静电吸引大小次序为：碱性氨基酸(A2+)>中性氨基酸(A+

4、)>酸性氨基酸(A°)氨基酸的洗脱顺序为：酸性氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。F.高效液相色谱(highperformanceliguidchromatography，HPLC)分辨率高洗脱速度快蛋白质的性质和分离纯化蛋白质的性质蛋白质的酸碱性质蛋白质分子的大小与形状蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的颜色反应蛋白质的分离纯化及含量测定蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的步骤蛋白质分离纯化的方法蛋白质含量的测定蛋白质分离纯化的目的1.研究蛋白质的分子结构；2.研究蛋白质的生物功能；3.蛋白质的应用

5、。蛋白质分离纯化的方法利用各种蛋白质的性质差别。蛋白质的性质1.蛋白质的酸碱性质蛋白质为两性电解质蛋白质等电点(pI)pH﹤pI,蛋白质带正电荷;pH﹥pI带负电荷;pH=pI时为两性离子。蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小；粘度、渗透压、膨胀性及导电能力也降为最低值。蛋白质的两性解离和等电点蛋白质在等电点的溶解度最小等离子点：指在没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH,为蛋白质特征常数。蛋白质相对分子质量(Mr)在6000～1000000之间。测定蛋

6、白质相对分子质量的主要方法化学组成法渗透压法超离心法（沉降分析法）凝胶过滤法聚丙烯酰胺凝胶电泳等。2.蛋白质分子的大小及其形状元素(分子)分子量最低Mr=元素(分子)百分含量例如:MbFe原子量(55.8)最低Mr=Fe元素百分含量(0.335%)=16700(一)化学组成法测定最低Mr(二)沉降速度法测定蛋白质Mr蛋白质在离心场中沉降时:Fc(离心力)=mpω2χFb(浮力)=Vpρω2χ=mpυρω2χFf(摩擦力)=fv=f(dχ/dt)通过测定沉降界面的移动速度测定Mr.dx/dt为常数时:Fc

7、-Fb=Ff(dχ/dt)mp（1-υρ）ω2χf=沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用s表示。s=(dx/dt)/ω2χ=mp(1-υρ)/f沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，s与Mr成正比。因此s常用作生物大分子的大小表示方法。由于s值较小，因此用1×10-13秒表示1个沉降系数单位（Svedbergunit）。S值与温度和溶剂有关，故一个分子的沉降系数定义为20℃，水溶液条件下的s值为标准。1S=1×10-13（s）由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的大小和形状的影响

8、，大小与质量有关、而形状与其扩散系数有关：mp=Mr/Nf=RT/NDs=mp(1-υρ)/fMr=——————RTsD（1－υρ）凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。其内部具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应,即可以把物质按分子大小不同进行分离,但这种“过筛”与普通的过筛不一样。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而