造血干细胞的研究及应用.ppt

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1、造血干细胞的研究与应用一：造血干/祖细胞的研究1.造血活动与造血假设2.造血干细胞与造血祖细胞3.造血干/祖细胞的性能测试4.造血干/祖细胞的分离纯化5.造血祖细胞的体外扩增与定向诱导分化二.造血干祖细胞的应用与前景内容造血活动血细胞的生成在胎儿，血细胞的生成开始于卵黄囊（0~2月），之后，在肝脏和脾脏（2~7月），骨髓（5~9月）为造血的主要场所。出生后，骨髓成为终身造血的大本营。血细胞类型与寿命类型1.淋巴系细胞：B淋巴细胞,T淋巴细胞2.髓系细胞:单核/巨噬细胞，粒细胞，巨核细胞，红细胞3.血小板寿命人类红细胞—120d

2、,中性粒细胞—36h,血小板9.6d造血假设以上事实都支持了这样的假设：在造血细胞中存在着一类原始的造血干细胞，它们能自我更新，并向各系细胞分化，从而维持机体正常的造血功能，使人体有恒定的血细胞数量。一造血干细胞（HSC）概念的提出：1.20世纪50年代，Lorentz等的骨髓移植实验成功，表明在造血细胞中存在一类原始的造血细胞即造血干细胞。2.1961年，Till和McCulloch发现将正常小鼠的骨髓细胞输注给受致死剂量X线照射小鼠，经9~11天后，受者小鼠脾脏表面生成了肉眼可见的由骨髓红系细胞，粒系细胞，巨核系细胞或三者

3、混合组成的脾集落，又称脾结节。每一个脾集落称为一个脾集落生成单位（CFU-S)。应用染色体C带显色和单个脾集落移植技术证明，每个脾集落中的细胞都是起源于单一细胞，通过它的增殖和分化而形成集落。这类生成脾集落的原始细胞称为脾集落生成细胞，它具备了多能造血干细胞或淋巴系-髓系干细胞的基本特性。脾集落生成细胞是一类最早被认识的造血干细胞，也是目前惟一能被测试的一类造血干细胞。然而，各个脾集落生成细胞的功能又是不均一的。造血干细胞（HSC）与造血祖细胞（HPC）HSC主要区别：高度的自我更新和维持能力不能扩增在体内长期或永久地重建造血

4、，永不消亡HPC高度扩增能力部分早期HPC和全部的晚期HPC丧失自我更新和自我维持能力分化到终末必然调亡关系：HSCHSC所有特征不变HPC边增殖边分化来维持成熟血细胞的数量造血干/祖细胞的性能测试造血干细胞性能测试1.经典方法-----脾集落测试法2.HSC的自我更新和造血重建能力的测试3.HSC的无限增殖和多向分化能力的测试造血祖细胞性能测试Till和McCulloch于1961年建立的脾集落技术到目前为止只能应用于小鼠等啮齿类动物，诸如兔，犬和人等均不能用这一方法检测。只能通过测定造血祖细胞的数量来相对说明造血干细胞的数

5、量，至于性能则更难说明。一般利用一些具有细胞遗传标志的HSC来生成脾集落，根据脾集落遗传标志的情况来研究造血干细胞的性能，主要有两种细胞遗传标志：1.辐射诱发的畸变染色体：可能对细胞的正常增殖与分化有影响，因此很难评估造血干细胞的性能。2.吴祖泽等利用天然性染色体作为细胞遗传标志1.经典方法-----脾集落测试法2.HSC的自我更新和造血重建能力的测试早期，根据ＨＳＣ存在于骨髓，脾脏及肝脏等造血组织和器官中，以及ＨＳＣ的形态类似于淋巴细胞等特点，通过分离单个核细胞，以此群体细胞的特性研究来推测ＨＳＣ的性能。人类ＨＳＣ移植技术的

6、成功，无疑是对人类HSC具有自我更新能力和长期造血重建能力的最有力证明。随着现代化技术手段的迅猛发展，实验动物学的发展为HSC的研究提供了很好的模型，为性能研究提供了更为直接的证据。动物体内实验验证1.HSC羊胎内移植2.重症联合免疫缺陷症(SCID)或人免疫缺陷（HID）小鼠体内移植3.SCID-HuThymus动物模型体内移植4.SCID-HuBone动物模型体内移植4.SCID-HuBone动物模型体内移植（1）先将一小段人胎肱骨埋于SCID小鼠皮下，约8周后移植物的血管已基本长好。（2）小鼠经射线全身照射后，把HLA不

7、相符合的人类HSC待测样品立即注射到移植物的骨髓腔内。（3）再过8周，取出移植物，一部分样品用作检测骨髓腔内细胞中的人类HSC和HPC，另一部分样品再一次注入第二个受射线照射的带有人肱骨移植物的SCID-HUBone动物模型体内。（4）再过8周，检测第2次移植物内是否有人类HSC，早期HPC，髓系祖细胞，B细胞祖细胞及其前体细胞，便可证明注入第1个胎骨移植物的原始样品是否含有高度自我更新能力的人类造血干细胞。3.HSC的无限增殖和多向分化能力的测试早期研究还是以脾集落入手。1984年，吴祖泽等以天然性染色体作为标志物，研究了小

8、鼠骨髓中HSC的增殖与分化特性。具体过程如下：（1）取与受体小鼠性别相反的正常小鼠骨髓的有核细胞输入到经致死剂量射线照射的受者小鼠，第13天后，受者小鼠生成脾集落。（2）之后将取自一个脾集落的细胞输入到经致死剂量射线照射的，与第一受者小鼠性别相同的第二受者小鼠体内，经过7~8