肽段化学衍生技术及其在质谱高灵敏度鉴定中的应用进展.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)评述与进展第7期2012年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1123～l129DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．11452肽段化学衍生技术及其在质谱高灵敏度鉴定中的应用进展乔晓强，王蕊张丽华杨更亮张玉奎(河北大学药学院，河北省药物质量研究重点实验室，保定071002)(中国科学院大连化学物理研究所，中科院分离分析化学重点实验室，大连116023)摘要鸟枪法串联质谱蛋白质鉴定是蛋白质组学研究中广泛采用的策略。然而，蛋白质组样品的高复杂性、宽动态范围

2、分布使得低丰度肽段以及难于离子化肽段的质谱检测仍然存在着巨大的挑战。为了提高质谱检测灵敏度，通过化学衍生技术在多肽中引入易于离子化的小分子标签的方法获得了广泛关注。本文综述了近年来应用于多肽及其翻译后修饰的化学衍生试剂，侧重其在高灵敏度质谱分析中的应用进展，并展望了化学衍生技术的发展方向及其在蛋白质组学中的应用前景。关键词化学衍生；高灵敏检测；质谱；多肽；综述1引言在后基因组学时代，蛋白质组分析受到越来越广泛的关注。然而，蛋白质组成的极端复杂性、可变性、宽动态范围以及翻译后修饰的存在，使得其分析面临着巨大的挑战】。复杂蛋白质样品的分离鉴定有两条主

3、要的研究策略，即Top—down策略和Bottom-up策略圆。Top—down策略是直接将蛋白质混合物分离后在蛋白水平上进行质谱鉴定。然而，受到当前分离和鉴定技术的限制，目前这一方法的应用相对有限。以鸟枪法(Shotgun)为代表的Bottom—up策略是目前广泛采用的技术，这一方法首先将复杂蛋白质样品经蛋白酶酶切，产生的多肽混合物再经多维液相色谱系统(HPLc)进行分离和串联质谱(Ms／MS)进行多肽序列的分析，从而实现蛋白质的鉴定12～4l。可见，质谱技术已经成为蛋白质组研究的重要工具。基于质谱技术的蛋白质研究的最大缺陷之一是由于肽段具有不

4、同的分子量、带电荷状态、亲疏水性以及二级结构，导致其质谱离子化效率具有很大的差异]，进而导致蛋白质酶解产物中部分肽段难于检测，尤其是翻译后修饰肽段。此外，复杂蛋白质样品的宽动态范围分布，使得低丰度肽段，如生物标记物和药物靶点蛋白的酶解产物陋的质谱信号受到高丰度肽段的抑制，在质谱检测方面仍然存在很大的困难。因此，发展针对难于离子化以及低丰度肽段的质谱高灵敏度检测技术对于提高蛋白质的鉴定能力具有重要意义。化学衍生法是色谱分析中常用的一种样品预处理方式[7】，是指采用特殊的化学衍生试剂(通常称为衍生化试剂或标记试剂)与待测物发生化学反应以改变待测物的物

5、理化学性能，从而增强其分析检测能力的方法。经衍生化处理后，可以采用紫外、电化学、荧光以及质谱等检测方式。近年来，随着质谱检测技术在蛋白质组学中的广泛应用，已发展了多种针对多肽质谱分析的化学衍生试剂。本文系统地总结了这方面的研究进展，并侧重介绍了其在肽段高灵敏度鉴定中的应用。2非修饰肽段衍生肽段的质谱离子化与其自身性质有着密切的联系。在电喷雾(ESI)质谱中，肽段通过喷雾液滴的去溶剂化作用进入气相离子化。在去溶剂化过程中，肽段的疏水性可加快肽段从液滴内部迁移到表面的速率；此外，肽段只有获得电荷才能检测，而碱性肽段更易于在气相中得到质子而离子化【&9

6、】。在基质辅201卜12-25收稿；2012-02-24接受本文系河北省科学技术研究与发展计划项目(No．11275530)、河北省自然科学青年基金(No．B2012201095)、河北大学自然科学研究计划项目(No．201卜225)和中国科学院分离分析化学重点实验室开放基金资助E-mail：xiaoqiao@hbu．edu．cn分析化学第4O卷助激光解析(MALDI)质谱中，分散在基质中的肽段经激光辐射获得能量而解吸附进入气相，并通过样品与激发态机体间的电荷转移而离子化。尽管其详细的机理尚不清楚，但普遍认为碱性的影响最大，因为高的气相碱性更易于

7、使肽段质子化；此外，疏水性肽段更易于与MALDI基质共结晶而解吸附，也可增强其信号强度。~1。可见，疏水性和碱性对提高肽段的质谱离子化具有重要作用。因此，肽段的衍生试剂往往具有疏水性和(或)含碱性结构的特征。根据化学衍生试剂在多肽中修饰位点的不同，主要包括氨基衍生、巯基衍生和羧基衍生；分别针对多肽中N末端氨基和赖氨酸的s氨基及精氨酸的胍基、半胱氨酸侧链巯基，以及C末端羧基和谷氨酸(天冬氨酸)的侧链羧基。2．1氨基衍生精氨酸的胍基与赖氨酸的e氨基相比具有更高的碱性。因此，在早期的工作中，研究人员通过化学衍生的方法建立了将赖氨酸转化为高精氨酸的胍基化

8、衍生技术，以提高多肽在质谱中的气相碱性]。Hale等[161采用0一甲基异脲使多肽中赖氨酸的e一氨基胍基化转化为高精氨酸，使得修饰肽段的