用于检测细胞中亚硝酰氢的近红外荧光探针及其生物应用.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第12期2015年12月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1829～1836DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150445用于检测细胞中亚硝酰氢的近红外荧光探针及其生物应用刘萍韩潇明，于法标“陈令新(中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室，山东省海岸带环境工程技术研究中心，中国科学院烟台海岸带研究所，烟台264003)(中国科学院大学，北京100049)摘要亚硝酰氢(HNO)是NO的单电子质子化还原产物。在治疗心血管疾

2、病中，HNO与NO起不同的药理活性。针对HNO活性高，难以实时检测的问题，本实验设计合成了一种新型不含金属离子的近红外荧光探针ER—JN，用于实时检测模拟生理条件下和活细胞内HNO浓度的变化。此探针由荧光团氮杂氟硼吡咯(Aza—BODIPY)和HNO的识别基团三苯基膦两部分组成。探针采用硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷。产品为墨绿色晶体，产率为28％。此探针具有灵敏性高、选择性强、细胞毒性低等优点，可用于定量检测模拟生理条件下HNO的浓度。检测前后探针的量子产量从0．叭增加到0．35。线性范围为0—50i~mol／L，探针的检出限(S

3、／N=3)是0．03pLmol／L。激光扫描共聚焦显微镜成像分析表明，此探针可以用于可视化检测活细胞内HNO浓度的变化。流式细胞分析的结果显示ER—JN能定性和定量检测细胞内HNO的水平。实验结论表明，探针ER—JN不仅能够检测溶液中的HNO，还能定位于细胞内质网，检测细胞中HNO的变化。可为研究亚细胞、细胞、器官乃及活体中HNO的生理病理功能提供重要的实验依据。关键词荧光探针；亚硝酰氢；细胞分析；近红外成像1引言亚硝酰氢(Nitroxyl，HNO)是一氧化氮(NO)的单电子还原并质子化的衍生物。其所具有的生物和药理作用特征与NO迥然

4、不同。由于其潜在的生物药理活性，近年来引起了广泛关注。HNO与心绞痛、急性高血压、动脉粥样硬化等众多心血管疾病有着紧密的关系J。有报导证实，在体内外实验中，AngeliS盐(HNO供体)是强效的血管舒张剂，它能引起离体大动脉、小阻力动脉及完整的冠状动脉舒张。另外，在心肌收缩功能方面HNO与NO所起的药理作用也不同，HNO以心肌肌浆的兰尼碱受体为靶点增强心肌收缩J。该药理特性为应对心力衰竭提供了一种潜在的治疗方案，并可有效避免硝酸甘油耐受性的问题。尽管越来越多的证据表明了HNO生物药理作用的重要性，然而由于HNO活性高，在生物体环境中极

5、易脱水发生不可逆的二聚化反应生成N，0_ll2J，使得对细胞内源性HNO作用机制的研究因缺乏有效的检测手段而无法顺利开展。传统的检测HNO的方法主要有电化学法、电子自旋共振波谱法、化学发光法和比色法等，。与这些方法相比，荧光探针法不仅具有灵敏度高、操作简单、选择性好、非侵入性等特点，还能对检测对象在原位进行实时监控和观察I9j。因此，设计合成能特异性响应HNO的荧光探针凸显重要。目前，检测亚硝酰氢的探针较少，且主要基于铜络合物_1]。该类含金属内核的荧光探针易受到细胞内源性还原物种，例如谷胱甘肽和抗坏血酸等的干扰；而且所报道探针的荧光

6、发射大多集中在紫外．可见区域，因为许多生物体及其组织在紫外一可见光的激发下会发射生物背景荧光，会严重干扰生物样品的荧光检测，严重影响了荧光分析的灵敏度和精确性。而近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长位于650—900am光区。该光区可有效避免生物背景荧光干扰，使探针能够获得较高的信噪比，并降低生物样品的光损伤H。本研究组一直致力于开发用于检测活性氮物种、活性硫物种和活性氧物种的荧光探针¨n。最近报道了用于检测HNO的荧光探针Lyso．JN和Cyto．JN_2o1。，并将其应用于活细胞内2015-05-28收稿；2015-08~1接受

7、本文系国家自然科学基金资助项目(Nos．21405172，21575159，21275158)和中国科学院青年创新促进会(Gran~015170)E—mail：tbyu@yic．ac．ca。lxchen@yic．ac．ca1830分析化学第43卷HNO水平变化检测，及小鼠体内HNO的荧光成像分析。在此基础上，本研究合成了新的ER．JN荧光探针，并用于定性和定量检测活细胞内的HNO。2实验部分2．1仪器与试剂◎NB、FPH．3C型酸度计(上海雷磁公司)；RF-5301PC型荧光分光光度计(岛津公司)；NanoDrop2000／2000C

8、型紫外可见分光光度计(ThermoScientifisher公司)；XS105型分析天平(MettlerToledo公司)；Cascade．bio型超纯水系统(Pall公司)；AVANCEIIITM500型核磁共振仪(B