微生物发酵工程案例教学.ppt

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1、EngineeredSaccharomycescerevisiaethatproduces1,3-propanediolfromD-glucose工程化啤酒酵母细胞利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇文献查找：张帆文献翻译：曾熙、朱悦、张帆PPT整理及展示：张艳丽（组长）二、背景三、实验方法一、摘要四、实验结果摘要在发酵产业中啤酒酵母是一种安全的微生物。1,3-丙二醇是一种广泛用于聚合物生产的重要化学原料，但是由于化学合成成本昂贵，它的实用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生产1,3-丙二醇。啤酒酵母利用D-葡

2、萄糖作为原料，能够生产丙三醇，而不是1.3-丙二醇。在本研究中，我们克隆了两个基因yqhD和dahB，这两个基因可以使丙三醇转化成1,3-丙二醇，把这两个基因通过农杆菌转化实验整合到啤酒酵母的W303-1A染色体上。这个工程化的啤酒酵母通过功能性yqhD和dhaB基因来实现D-葡萄糖到1,3-丙二醇的生产。据了解，该研究在1,3-丙二醇生产产业中是一种安全的、低成本的方法。背景背景使用与成本的矛盾降低成本化学合成发酵背景克雷伯肺炎菌：在克雷伯肺炎菌中，参与1,3-丙二醇的生物合成的基因是dhaB和dhaT。DhaB是一种依赖

3、维生素B12的脱水酶，它转化丙三醇到3-羟基丙醛，而DhaT是一种依赖NADH的氧化还原酶，它可以转化3-羟基丙醛到1,3-丙二醇。大肠杆菌：大肠杆菌能利用D-葡萄糖生产丙三醇，可以通过把dhaB和dhaT基因整合到大肠杆菌来生产1,3-丙二醇，但是DhaT活性过低，导致收率低。yqhD基因的发现解决了这一问题。背景克雷伯肺炎菌的生产原料是丙三醇，价格昂贵。大肠杆菌产生内毒素，可能引起疾病。啤酒酵母已经用于发酵产业好多年了，主要是由于它使用D-葡萄糖这种低成本原料作为碳源和能源。野生型啤酒酵母只产生丙三醇，但没有产生1,3-

4、丙二醇的能力。背景实验方法一、材料：PCR试剂、限制酶、小牛碱性磷酸酶、凝胶提取盒、尼龙膜等二、培养基和生长条件实验方法四种培养基：发酵条件：有氧环境、摇床250rev/min30℃。LB培养基YPD培养基B培养基CM培养基实验方法用于这项研究的菌株、质粒和引物：实验方法DNA片段的PCR扩增分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒土壤农杆菌介导的转化啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析气相色谱法测定1,3-

5、丙二醇实验方法分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒；构建pZR3质粒；构建包含yqhD和dhaB基因的质粒pZR4实验方法土壤农杆菌介导的转化在本研究通过农杆菌介导的转化方法将yqhD基因和dhaB基因整合到啤酒酵母的染色体上。第一步，质粒pZR4通过电穿孔转染到农杆菌LBA4404，形成LBA4404-ZR4.农杆菌LBA4404-ZR4在含有博来霉素的B培养基上培养过夜，收菌，在B培养基上重悬培养（含或不含100umol/l乙酰丁香酮），生长到1x1011cellml-1，再孵化培养6h。与

6、此同时，啤酒酵母W303-1在摇床30℃下培养过夜，稀释20倍到新鲜的YPD培养基上，培养6h。细胞通过离心收集，用不含乙酰丁香酮的B培养基清洗，然后重悬，接种到相同培养基上，最后生长到1x109cellsml-1.随后，50ul啤酒酵母W303-1A和50ul农杆菌LBA4404-ZR4做好前期混合准备，储存在高压蒸汽过的胶膜纸上（直径25mm），上面有固体CM培养基，添加乙酰丁香酮，孵育在28℃，72h。然后，胶膜纸被移到固体YPD培养基（含150ug/ml博来霉素），孵育30℃，3-4days。为了预防供体农杆菌过生长

7、，在培养基中添加了200ug/ml头孢噻肟。啤酒酵母指定的W303-1A-ZR，在30℃，YEPD（含150ug/ml博来霉素）培养基中进一步纯化。实验方法啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析：实验方法酶试验细胞粗提物通过细胞糊状物声波破碎和离心获得，细胞粗提物含各种酶。丙三醇脱水酶活性通过使用3-甲基-2-苯并噻唑方法评估。由于3-羟基丙醛的不稳定性，1,3-丙二醇氧化还原同工酶活性通过逆反应（1,3-丙二醇转化到3-羟基丙醛）来断定。1,3-丙二醇同工酶的浓度通过Gerlind方法断定。所有酶试

8、验在30度中进行。一个酶活单位定义成：30度下，催化1umol底物到产物所需的酶数量。特殊的酶活力显示的单位/mg蛋白。所有酶试验重复两次，报道的数值是两次实验的均值。细胞提取物中的蛋白浓度是通过Bradford法断定的。实验方法气相色谱法测定1,3-丙二醇：1,3-丙二醇和丙三醇是通过气