青蒿琥酯抑制肝星状细胞microRNA―154- β―catenin治疗肝纤维化的机制研究.doc

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1、青蒿琥酯抑制肝星状细胞microRNA-154/B—catenin治疗肝纤维化的机制研究［摘要］目的探讨青蒿琥酯抑制肝星状细胞microRNA-154/P-catenin治疗肝纤维化的机制。方法培养大鼠肝星状细胞，用不同浓度(0、5、10、20、30、40Ug/mL)青蒿琥酯作用于大鼠肝星状细胞，采用免疫印迹法(Westernblot)检测青蒿琥酯作用后细胞内B-catenin蛋白的表达;实时定量RT-PCR检测青蒿琥酯作用后细胞内的miR-154和P-cateninmRNA的相对表达。结果0〜40ug/mL青蒿琥酯作用细胞24h后，免疫印迹法结果显

2、示，3-catenin蛋白量逐渐降低，并呈剂量相关性(P青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素的衍生物，前期研究发现青蒿琥酯可以促进肝星状细胞的凋亡［10］,本实验深入探讨了青蒿琥酯作用后HSC中Wnt/P-catenin信号通路中的蛋白表达含量及microRNA-154的表达量变化，研究两者在促进HSC凋亡过程中的相关性。为探讨青蒿琥酯抗肝纤维化的作用机制提供实验基础。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株大鼠HSC(HSC-T6)购于上海艾研生物有限公司，由美国ATCC细胞库引进，为SV40转染的大鼠肝星状细胞，其表现型为活化的HSC细胞。1.

3、1.2试药注射用青蒿琥酯（桂林南药股份有限公司）；RPMI-1640培养基（上海吉诺公司）；胎牛血清（美国Gibico公司）；胰蛋白-EDTA消化液（美国Gibico公司）；DMS0（美国Sigma公司）；96、6孔板（美国Corning公司）;SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉谷歌生物有限公司）;B-catenin—抗（美国CellSignalingTechnology公司）；二抗羊抗兔IgG（美国LI-C0RBiosciences公司）；RNA提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒及RT-P

4、CR试剂盒（日本TaKaRa公司）;引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司设计并合成。1.1.3仪器超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）;CB150C02纟田胞培养箱（德国Binder公司）；HeraeusFresco21低温微量离心机（德国Thermo公司）；Odyssey双色红外激光成像系统（美国LI-COR公司）；NanoDrop2000c紫外分光光度计（美国ThermoScientific公司）；普通RT-PCR仪（东胜创新生物科技有限公司）；7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；荧光定量PCR管（美国ABI公司）。1.2方法1

5、.2.1细胞培养取大鼠HSC（HSC-T6）用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）培养，于379、5%C02饱和度的细胞培养箱内进行培养，待细胞生长密度大约为90%时，倒掉培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)平衡盐溶液轻轻洗涤细胞2次，弃去PBS,用0.5mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，待细胞收缩变圆并开始滑落，立即加入培养基终止消化。轻轻吹打混悬细胞，1000r/min离心5min,弃上清，用培养基将细胞吹散混悬，进行传代或种板。以3X105个细胞/孔将细胞接种于6孔板，待细胞生长密度至

6、60%〜70%时，分别换成用含5、10、20、30、40ug/mL青蒿琥酯的培养基进行培养，并设一孔加等量不含药培养基作为对照组，培养24h后，提取蛋白质和RNAo1.2.2细胞总RNA的提取青蒿琥酯作用24h后收集细胞，按照TrizolRNA提取试剂盒操作说明提取总RNA。加入1mLTrizol反复吹打使细胞充分裂解，静置15min,加入0.2mL氯仿(Trizol:氯仿=5:1),剧烈振荡颠倒30s,室温静置15mino4°C,12000r/min离心15mino移上清液至无酶离心管中，加入等体积异丙醇，静置10min；4°C,12000r/mi

7、n离心15min,弃上清液，加1mL预冷的75%乙醇，洗涤RNAo4°C下7500r/min离心10min,重复1次。晾干至半透明，加入适量焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA,紫外分光光度计测定浓度及纯度，于-80匸保存备用。1.2.3免疫印迹法(Westernblot)测定青蒿琥酯作用后细胞内3-catenin蛋白表达变化青蒿琥酯作用24h后收集各孔细胞，PBS轻轻洗涤2次，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定提取的蛋白浓度。加上样缓冲液，1009加热煮沸7mino每组取20ug总蛋白上样，利用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组细

8、胞蛋白质，电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜用5%BSA封闭液封闭lh,用封闭液稀释相应的一抗，一