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《临床治疗用ASIC-CIK细胞制备标准操作程序.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、临床ASIC-CIK制备标准操作规程编号版本号1.0执行日期2016-06-01起草人审核人批准人批准人签名变更版本号变更日期变更原因及H的【目的】建立临床ASIC-CIK制备的标准操作规程【适用范围】CIK制备组的所有人员【规定】【附件】【相关文件】【规程】1.PBMC（外周血单个核细胞）分离1.1仪器:仪器品牌型号超净工作台苏净安泰BCM-100AC02培养箱Thermo3111冷冻离心机ThermoST-16R倒置显微镜明美MI12冰箱海尔BCD-241WDBB液氮罐Thermo8117超低温冰箱Ther
2、mo902电动移液器Thermo1ml手动移液器Thermo200ul手动移液器ThermolOOul手动移液器Thermo20ul手动移液器Thermo1.2试剂耗材:试剂品牌规格货号人淋巴细胞分离液Lymphoperp500ml/瓶LYS3713D-PBSGibco500ml/瓶AIM-V无血清培养基Gibco1000ml/瓶OKT3Biolegendlmg/支302013TFN-Y上海凯茂200万IU/支无RctroncctinTAKARA2.5ml/瓶DMSOsigmaHABGemcell100ml/瓶
3、异内醇T-75培养瓶15cm培养1111Thermo168381冻存盒Thermo7216397010冻存管Thermo37726750ml注射器广西双健科技15>50ml离心管Corning25ml移液管Thermo25ml429532lOOOul枪头QSPT112NXLRS-Q1.3试剂配制:1.3.1TFN-Y:浓度1000IlJ/mlo200万IU粉末一支,2mlD-PBS稀释,分装EP管,1ml/支。4°C保存。1.3.2包被液血!制:每20rnlPBS加入1ml浓度为lmg/ml的Rctroncct
4、in（TAKARA）以及10Oul浓度为lmg/ml的OKT3（Biolegend）«4°C保存。1.33冻存液配制：HAB：DMSO=9：11.4操作步骤：1.4.1准备50ml的离心管2支（由血液样本体积而定，按照每管装25ml血液样木计算，一般采集血液样本50ml）,标记好患者的姓名、LI期，将血袋屮的血液转移到离心管屮，使用经灭菌消毒的剪刀剪断數料管，将富集的约50ml细胞富集血液用50ml无菌注射器从采血袋屮吸出，分别转移到2个50ml的离心管屮，每个25ml,再加入25mlPBS稀释成50mlX2管
5、，10ml移液管轻轻混匀。（取样lml做原血留样）1.4.2准备4支50ml的离心管，标记好病人的姓名、□期，用25ml移液管分别装入25ml室温的淋巴细胞分离液，将步骤4」所稀释的血液用10ml移液管沿管壁缓慢转移到已经准备好的装有25ml淋巴细胞分离液的离心管屮的淋巴细胞分离液上方，注意铺层的整个过程不能打破淋巴细胞分离液与血液样木的分界面，800gX20min,室温，离心（TIPS：离心转速应选择快加速慢减速，升档9降档4,移液器释放液体速度调到最低档档位）。1.43提取单个核细胞：经离心后离心管内明显分
6、层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、flcoll层、单个核细胞层、血浆PBS稀释层。离心后的4支50毫升离心管，用巴氏吸管将血浆层弃去,直至距白膜层5mm处,将每一管的单核细胞层吸入到另一个新的50ml离心管中，最后得到50mlX4管，用PBS定容至50ml,混匀，600gX10min,室温，升档9降档9洗涤一次。1.4.4弃去上清，用50mlPBS重悬，400gX10min室温，升档9降档9离心洗涤。1.4.5弃去上清，用50mlPBS重悬，300gX10min室温，升档9降档9离心洗涤。细胞沉淀即为PB
7、MC细胞。1.4.6用含体积比2%HAB的AIM-V培养基将细胞重悬，计算所得细胞数，计数后加入含2%HAB的AIM-V培养基将细胞密度调整为3^5X10A6/ml,将细胞转移至15cm贴壁培养1111,每1111加15ml2%HAB的AIM-V培养基，置于饱和湿度、37°C、5.0%CO2的培养箱屮培养1.4.7贴壁211后，取出培养11L,轻轻晃动将没有贴壁的细胞晃起来，将没有贴在培养imilll舉的细胞吸到几个新的50ml的离心管屮，500gX10min升9,降9离心，留其中一管的上清，其余上清弃去。用留
8、下的上清将其余几管细胞重悬，并将所有几管细胞汇于一管屮，吹匀，计算剩余细胞数，计算5-9X10A7细胞需要的体积Vml。计算公式：50ml细胞悬液计数后的细胞总数为A,5-9X10A7细胞需要的体积Vml“5-9xl0A7x50v=—X—1.4.8准备一个新的T75培养瓶，标记好患者的姓名、细胞类型、丨I期，加入XOml的AIM-V,将步骤4.7的细胞吹匀，吸取Vml的细胞到T75屮，
