临床治疗用ASIC-CIK细胞制备标准操作程序

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1、临床ASICCIK制备标准操作规程编号版本号1.0执行日期2016-06-01起草人审核人批准人批准人签名变更版本号变更日期变更原因及目的【目的】建立临床ASIC-CIK制备的标准操作规程【适用范围】CIK制备组的所有人员【规定】【附件】【相关文件】【规程】1・PBMC（外周血单个核细胞）分离1.1仪器：仪器品牌型号超净工作台苏净安泰BCM-100AC02培养箱Thermo3111冷冻离心机ThermoST-16R倒置显微镜明美Ml12冰箱海尔BCD-241WDBB液氮罐Thermo8117超低温冰箱Thermo902电动移液器Thermo1ml手动移液器Thermo200

2、ul手动移液器Thermo100ul手动移液器Thermo20ul手动移液器Thermo1.2试剂耗材:试剂品牌规格货号人淋巴细胞分离液Lymphoperp500ml/瓶LYS3713D-PBSGibco500ml/瓶AIM-V无血清培养基GibcolOOOmi/瓶OKT3Biolegendlmg/支302013TFN-Y上海凯茂200万［U/支无RetronectinTAKARA2.5ml/瓶DMSOsigmaHABGemcell100ml/瓶异丙醇T-75培养瓶15cm培养皿Thermo168381冻存盒Thermo7216397010冻存管Thermo37726750

3、ml注射器广西双健科技15、50ml离心管Corning25ml移液管Thermo25ml429532lOOOul枪头QSPT112NXLRS-Q1.3试剂配制：1.3.11FN-Y:浓度10001U/inlo200万IU粉末一支,2mlD-PBS稀释,分装EP管，1ml/支。4°C保存。1.3.2包被液配制：每20mlPBS加入1ml浓度为lmg/ml的Retronectin（TAKARA）以及100ul浓度为lmg/ml的OKT3（Biolegend）□4°C保存。1.3.3冻存液配制：HAB：DMSO=9：11.4操作步骤：1.4.1准备50ml的离心管2支（山血液样

4、本体积而定，按照每管装25ml血液样本计算，一般采集血液样本50ml）,标记好患者的姓名、日期，将血袋中的血液转移到离心管中，便用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，将富集的约50ml细胞富集血液用50ml无菌注射器从采血袋中吸出，分别转移到2个50ml的离心管中,每个25ml,再加入25mlPBS稀释成50mlX2管,10ml移液管轻轻混匀。（取样lml做原血留样）1.4.2准备4支50ml的离心管，标记好病人的姓名、日期，用25ml移液管分别装入25ml室温的淋巴细胞分离液，将步骤4」所稀釋的血液用10ml移液管沿管壁缓慢转移到已经准备好的装冇25ml淋巴细胞分离液的离心管中的

5、淋巴细胞分离液上方，注意铺层的整个过程不能打破淋巴细胞分离液与血液样本的分界面，800gX20min,室温，离心（TIPS：离心转速应选择快加速慢减速，升档9降档4,移液器释放液体速度调到最低档档位）。1.43提取单个核细胞：经离心后离心管内明显分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、ficoll层、单个核细胞层、血浆PBS稀释层。离心后的4支50毫升离心管，用巴氏吸管将血浆层弃去,直至距口膜层5mm处，将每一管的单核细胞层吸入到另一个新的50ml离心管小，最后得到50mlX4管，用PBS定容至50ml,混匀，600gX10min,室温，升档9降档9洗涤一次。1.4.4弃

6、去上清，用50mlPBS重悬，400gX10min室温，升档9降档9离心洗涤。1.4.5弃去上清，用50mlPBS重悬，300gX10min室温，升档9降档9离心洗涤。细胞沉淀即为PBMC细胞。1.4.6用含体积比2%HAB的A1M-V培养基将细胞重悬，计算所得细胞数，计数后加入含2%HAB的AIM-V培养:基将细胞密度调整为3-5X10A6/ml,将细胞转移至15cm贴壁培养皿，每皿加15ml2%HAB的AIM-V培养基，置于饱和湿度、3TC、5.0%CO?的培养箱中培养1.4.7贴壁2h后，取出培养皿，轻轻晃动将没冇贴壁的细胞晃起来，将没冇贴在培养皿皿壁的细胞吸到几个新

7、的50ml的离心管中，500gX10min升9,降9离心，留其中一管的上清，其余上清弃去。用留下的上清将其余几管细胞重悬，并将所有几管细胞汇于一管中，吹匀，计算剩余细胞数，计算5-9X10A7细胞需要的体积Vml。计算公式：50ml细胞悬液计数后的细胞总数为A,5-9X10A7细胞需要的体积Vml5-9X10八7X501.4.8准备一个新的T75培养瓶，标记好患者的姓名、细胞类型、日期，加入80ml的AIM-V,将步骤4.7的细胞吹匀，吸取Vml的细胞到T75中，轻轻混匀，留样约1ml细胞于EP管中，做细胞质控检测