【精品】实验二细菌的接种、培养及代谢产物.doc

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1、实验二细菌的接种、培养及代谢产物(BacterialInoculetionandArtificalCultureandMetaboicproducts)一、细菌的人工培养(ArtificalCultureofBacteria)在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。(一)常用培养基的制备1、肉汤培养基：是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。材料：(制备100ml肉汤培养基的用量)(1)培养基的成分：牛肉50g蛋白脂lg氯化钠0・5g磷酸氢二钾(K2HP04・l2H20)O.lg

2、蒸憾水100m1(1)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1/20N的NaOH、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸憎水。方法：(1)将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g,加蒸馆水100ml,放入冰箱中过夜。(2)加热45—50°C-小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸丫留水补足其量为100ml。(3)于滤液屮加氯化钠0・5g,蛋白脂lg、磷酸氢二钾O.lg,加热使之完全溶化。(4)测定酸碱度并调整至PH7.6,必要时用滤纸过滤。(5)按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅/寸220—30分钟灭菌。(6)灭

3、菌后置37°C温箱，孵育24h,无杂菌生长，即可应用。或放冰箱备用。2、普通琼脂培养基它是最常用的固体培养基。材料：肉汤、琼脂方法：(1)在肉汤中加入2%琼脂，熔化后调整PH7.6，必要时用棉花纱布过滤。(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。(4)取出，将试管斜摆，琼脂凝固后即成普通琼脂斜面。将烧瓶内琼脂培养基在未凝固前以无菌操作注入无菌平皿内，凝固后即成普通琼脂平板，倾注时应严格要求无菌操作。琼脂的温度应在50°C左右为宜。如温度过高则平皿内凝水过多。易致污染：过低则琼脂凝固而致培养基表面不平滑

4、。(5)将琼脂斜面及平板放入37°C温箱内，孵育24h,若无菌生长，即可应用或放入冰箱保存备用。3、半固体培养基材料：肉汤、琼脂方法：在肉汤中加入0・5%的琼脂，熔化后分装于小试管中，每管约2ml,加棉塞及包装。然后放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸230分钟灭菌。取出直立，待凝固后即成半固体培养基，放37°C温箱24小时，若无菌生长，即可应用，或放入冰箱保存备用。4、血液琼脂培养基有些细菌营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养。材料：普通琼脂培养基、血液。方法：将制好的普通琼脂培养基加热熔化，待冷至5(TC时以无菌操作加入5—10%脱纤维兔血

5、或羊血，混匀，分注于灭菌试管或平皿中，制成血液琼脂斜面或血液琼脂平板，放37°C温箱24小时，若无菌生长，即可应用，或放入冰箱保存备用。(二)细的接种方法1、普通方法(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。(2)左手握斜面培养基下端，斜面向上，用右手小指和无名指拔出斜面培养基棉塞，管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入W内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线。注意勿划破培养基。(2)接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌。2、液体培养基接种法(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。(2)以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上,然后将试管稍倾斜，

6、使细菌混于液体中即可。3、半固体培养基接种法左手持半固体培养基，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌，垂直刺入半固体中心，至近管底部,然后沿穿刺线退出。塞冋棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37°C培养18—24h,观察生长情况。4、平板划线接种法本法耍求通过划线将标本中混杂的细菌在平板表面分散开，并在其生长繁殖形成菌落。以达到分离培养的目的。其操作方法是：(1)右手将接种环按灭菌操作法沾取少许标本或培养物，左手拿平板略开盖，将标本涂于平板表面之一侧边缘，运用腕力作连续划线(但不要重叠，切勿划破琼脂)，约占平板面积1/4o(1)先旋转平板约70—90度，将接种环火焰灭菌，

7、冷却后通过第一次划线取2—3次。再作同样连续划线又占平板面积约1/4。(2)重复上述操作，划完整个平板。(3)将平板倒放于37°C温箱内，18—24h,观察各菌落情况。(三)细菌的培养方法欲使细菌生长繁殖，除了适宜的培养基外，尚需适当的温度，及一定的环境条件，例如有的细菌生长需要氧，有的则需要在无氧环境下才能生长，因此培养细菌时通常用以下几种方法：•需氧培养法：将已接种的试管或平板培养基置37°C温箱中培养18-24ho2、厌氧培养法：将细菌生长环境中的空气排出或用其它理化方法使细菌与氧隔离，造成无氧环境。（具体方