门冬胰岛素的制造.doc

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1、门冬胰岛素的制造%1.研究目标采用基因工程方法対门冬胰岛素的28位进行突变，使脯氨酸替换成门冬氨酸%1.研究内容通过PCR技术与构建突变体，再与PMD-19T载体连接，导入大肠杆菌进行表达筛选得到门冬胰岛素%1.实验方法与步骤1.先从Genebank中找到人胰岛素序列，从中标出A链和B连的序列。GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCC77TGTG4ACCAACACC

2、TGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTTGGACCCAGCTTTCT

3、TGTAC斜体标记的是B链的序列，加粗标记的是A链的序列目的是将CCC（脯氨酸）——gac（天门冬氨酸）2.设计引物B链上游引物5'-3'CTTGGATCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACA（BamHI）下游引物5,-3,CTTGAATTCGGTCTTGTCTGTGTAGAAGAAGCCTCGT（EcoRI）A链上游引物5'・3'CTTGGATCCGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAG（BamHI）下游引物5'・3'CTTGAATTCCTACCAGCTGGAGAACTACT

4、GCAAC（EcoRI）3.PCR反应（分别扩增A链和B连）以及测定1）在含有DNA序列模板、引物、DNA聚合酶、dNTP缓冲溶液中通过变性、退火、延伸三个步骤扩増DNA并实现相应位点的突变°具体：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNAXZ链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA«Yl-链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA

5、模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链2）取PCR扩增产物和DNADL2000Maker于I%的琼脂糖凝胶中进行电泳，100V约2min,待样品出点样孔后，调节电压至80V继续电泳30min,紫外灯下观察，初步检测扩增目的基因的大小4.将PCR扩增片段A链和B链通过TA克隆分别连接到克隆载体PMD-19T载体中（PMD-19T载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，消除了LacZ基因的多克隆酶

6、切位点，但不影响B•半乳糖廿酶的农达，因此亦可使用蓝白斑筛选挑选阳性产物）连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接得到重组子1.将酶连片段转入大肠杆菌感受态DH5a中，筛选阳性克隆子通过蓝白斑筛选法筛选出阳性克隆子原理：载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有B•半乳糖苗酶基因(lacZ)。在这个编码区中插入了-•个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到卜半乳糖苛酶的氨基端而不影响功能。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同吋存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样

7、,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒Z间实现了互补，称为-互补。山-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然Iflj,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无a■互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。2.将阳性克隆子和表达载体pGEX用BamHI和EcoRI双酶切，冋收片段(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，装入离心管中。注意：尽昴切除不含目的DNA部分的凝

8、胶，尽昴减少凝胶体积，提高凹收率。(2)称悬出离心管中凝胶的质量，计算出胶块体积，以lnig^luL进行计算。(3)向胶块中加入3倍体积的胶块融化液。(4)离心(8)将RinseA离心弃滤液。(9)将的RinseB离心,弃滤液。(10)重复上述步骤。洗脱3.将A链和B链的片段分别于载体PGEX-3X连接在人胰甜素原基因的5,端加上甲硫氨酸密码子，接在色氨酸合成酶基因Z后，插入质粒4.将