《基因敲除与药学》PPT课件.ppt

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1、第九章：基因敲除与药学基因敲除技术与诺贝尔奖三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了2007年诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的MarieCapecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliversmithies教授以及英国加蒂夫大学的MartinEvans教授基因敲除简介定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。1234567123456790890RNAi同源重组插入突变基因敲除（geneknock-out）通常所说到的基因敲除，又称基因打

2、靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。应用DNA同源重组原理进行基因敲除同源重组插入突变RNAi同源重组插入突变发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。要有将外援基因导入宿主细胞的载体2.能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞）基因敲除的必备条件基因敲

3、除载体通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中，一个好的载体应具备以下特点：能在宿主细胞中稳定存在2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即multiplecloningsite(MCS),便于外源基因的插入。常用质粒。3.具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的ES细胞进行筛选。常用的筛选标记为正负筛选：Neo（新霉素磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-tk（单纯袍子病毒胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。Neo新霉素基因阳性的ES细胞可以再含有G418（一种新霉素的类似物）的培养基上

4、生长。HSV-tk基因阳性的ES细胞，编码的基因产物可以将更昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死。胚胎干细胞（简称ES细胞）胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。（1）基因敲除载体的构建Step1.获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此DNA片段克隆到一般质粒中；Step2.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；Step3.将neo基因和HSV-tk克隆到质粒中；基因敲除的基本程序根据载体与靶基因组同源序列双链

5、断裂位点位置的不同，基因载体通常分为两种：1．插入性载体(gene-insertionvector)2．置换型载体(gene-replacementvector)大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。（2）基因敲除载体导入ES细胞将基因敲除载体导入ES细胞，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因，从而得到基因敲除细胞基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子载体法等1.正负双向

6、筛选系统（PNS）：Nero基因表达，ES细胞抗新霉素，在G418的培养基中存活。HSV-tk基因表达，在更昔洛韦的培养基中，ES细胞被杀死。（3）常用的筛选方法有两类2.正向筛选又称标记基因的特异性表达法，仅有正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏自身的某个表达调控序列。标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达。可以分为无启动子筛选法，无增强子筛选法，无poly（A）筛选法。（2）常用的筛选方法有两类3．物理筛选方法主要是PCR筛选方法，优点是灵敏，专一性强；。此外还有富集或筛选率比较

7、高时，可以用Southernblot杂交法，（2）常用的筛选方法有两类（3）基因敲除的ES细胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中导入动物胚胎后，可以发育成嵌合子或完全ES来源的动物。嵌合体动物与正常的动物杂交，子代动物再杂交，有可能产生杂合型突变体。（5）嵌合体的杂交育种得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。一、条件性基因敲除法：将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基

8、因敲除方法。在传统基因敲除的基础上，利用了特异性重组酶系统作为调控的按钮，实现对基因的时刻可调节敲除。与Cre-loxp重组酶系统有关。第三节：基因敲除进展及前景：条件性基因敲除优点：①目标基因的敲除可以限定在特定的组织、细胞或发育的特定阶段；②可避免因基因突变而致死胎的问题：③在2个loxP位点之间的重组率较高；④如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导