《基因敲除新技术》PPT课件

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1、ZFN技术原理锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。ZFN技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN

2、库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。崭新的技术-TALEN经典的挑战–染色体DNA序列的人工编辑修改（点）突变：Silent；Missense；Nonsense；Frameshift（基因敲除，Knockout）片段删除片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗崭新的技术解决经典的挑战靶向基因技术经典方法：自杀质粒，同源重组–几率低(~1HReventper106cells），难！饱含希望与失望的技术：ZFN，被Sigma公司垄断新的里程碑：TALENTALEN技术基于TALEN(t

3、ranscriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。2007年发现其序列特异性核酸结合特性，avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应

4、关系被破译由34个aa组成一个单元模块，重复17-18次34个aa中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)对应识别一个目标碱基TALEN发展过程人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元……14–18个重复真核表达……14–18个重复特异识别指定的14-18个核酸序列并与之结合34氨基酸单元TALEN发展过程TALEN(TALE+FOKI)表达质粒对TALEN基因敲除X2TALEN表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joini

5、ng，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体TALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级DonorplasmidHRDonorplasmidLeftarmRightarmDonorplasmidLeftarmRightarm点突变片段删除基因敲入2011年8月，NatureBiotechnology上同时发表了用TALEN技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。一篇人类干细胞《Geneticengineeringofhumanpluripotentcel

6、lsusingTALEnucleases》一篇大鼠《KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs》两篇斑马鱼《TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs》《HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs》一篇综述《MoveoverZFN》TALEN的最前沿TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程选择、确定靶点2.TALE识别模块

7、串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体X2X2X2靶点的DNA序列特征：相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点参考文献：Cermaketal.,EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12,e82.在线靶点选择设计软

8、件：https://boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-off/选择确定TALE靶点TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD）RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系