禽流感（H9亚型）制造及检验试行规程.doc

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1、禽流感(H9亚型)制造及检验试行规程本品系用A型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jiangsu/JY/99(II9N2)株(简称JY株)接种易感鸡胚，收获胚液，超滤浓缩，经甲醛溶液灭活后，与矿物油住剂混合乳化制成。用于预防H9亚型禽流感。毒种1.1制苗及效检用H9亚型AIV毒种均为JY株，由扬州优邦生物制药有限公司鉴定、保管和供应。1.2毒种标准1.2.1AIVJY株毒种标准1.2.1.1病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10°、10=10*3个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1m

2、l,置36〜37°C继续孵育，24小吋以前死亡的鸡胚弃去不计，在24〜96小吋死亡的鸡胚随吋取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价,至96小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价21：64者判为感染,计算EIDsoo每0.1ml病毒含量应^107<)EID5oo1.2.1.2红细胞凝集价按现行《屮国兽药典》附录进行，含毒鸡胚液对1%鸡红细胞凝集价应Ml:256。1.2.1.3对鸡胚的毒力用灭菌生理盐水将毒种作1：10000稀释，尿囊腔内接种9〜11日龄SPF鸡胚20枚

3、，每胚0.lml(约103OEID5o),接种后24〜96小吋内，应至少有18个鸡胚死亡。剖检观察，死亡鸡胚应出现全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。121.4对雏鸡的毒力用灭菌生理盐水将毒种作1：10稀释，翅静脉接种4〜8周龄SPF鸡10只，每只鸡0.2ml,接种后观察10R,鸡只应不出现死亡或明显异常反应但有个别鸡出现轻微的呼吸道症状。接毒后第5R,采集泄殖腔拭子，用9〜11口龄SPF鸡胚分离病毒，至少9只病毒分离阳性。1.2.1.5特异性用灭菌生理盐水将毒种稀释成含4HA单位的抗原液，分别与ND、EDS、H5亚型禽流感

4、、H7亚型禽流感阳性血清,SPF鸡血清和H9亚型禽流感阳性血清作HI试验，毒种对H9亚型禽流感阳性血清应为阳性，对ND等其它阳性血清及SPF鸡血清均应为阴性。1.2.1.6免疫原性用生理盐水将毒种作适半稀释后，接种鸡胚制备病毒抗原液，经甲醛溶液灭活后，加油低剂制成油包水型灭活疫苗，按以下方法进行检验：1.2.1.6.1血清学方法用21〜28H龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0•加1,另5只作对照。接种后21〜28口，每只鸡各采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体（见附注1和附注2）。免疫组HI抗

5、体效价的几何平均值应不小于6.51。创，对照组HI抗体效价的儿何平均值应不大于2.01og2o1.2.1.6.2免疫攻毒法用21〜28口龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml,另5只作对照。接种后21〜28日，用1：10稀释的AIVJY毒种进行翅静脉注射，每只鸡0.2mlo攻毒后第5H,分别采集每只鸡的泄殖腔拭子，每个样品经尿囊腔接种9〜11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml,孵育观察5R,逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚屮只要有1枚鸡胚胚液的I【A效价：16（微量法），即可判为病毒分离阳

6、性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。免疫组应至少有9只鸡病毒分离阴性，对照组应至少有4只鸡病毒分离阳性。121.7纯净按现行《屮国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。1.2.1.8基础种子代次E2〜E8代。1.3毒种保存AIVJY株，在-20°C以下，保存期为24个月。2疫苗制造及半成品检验2.1生产用毒种的制备2.1.2ATV生产用毒种的制备。2丄2」AIV毒种繁殖用灭菌生理盐水将毒种作10J至105稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml,选接种后48〜96小时死亡且病痕明显

7、的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌且对1%鸡红细胞悬液凝集价21：256的鸡胚液混合，定量分装，冷冻保存。注明收获口期、毒种代数等。2」.2.2毒种鉴定按1.221、1.222及1.227项进行，应符合规定。符合以上标准的毒种作为生产用种子。2.1.2.3毒种保存-70€以下保存，保存期为6个月。2.1.2.4毒种继代应不超过3代。2.2制苗材料的选择选用发育良好的10〜11日龄的健康易感鸡胚。2.3制苗用毒液的制备2.3.2ATV病毒液的制备2.3.2.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适

8、半稀释（如10“或10'稀释），每胚尿囊腔内接种0.lml,密封针孔，置36〜37°C继续孵育，不必翻蛋。2.3.2.2孵育和观察接种后24小时内，每H照蛋1次，将24小吋内死亡的鸡胚弃去。此后，每4〜6小时照1次，将死亡的鸡胚随时取出，直至120小时。120小时后鸡胚不论死亡与否，将全部