转基因植物及其产品检测-质量控制与标准物质应用.ppt

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1、转基因植物及其产品检测质量保证与标准物质应用金芜军中国农业科学院生物技术研究所2010-05-06，杭州主要内容一、PCR检测质量保证二、核酸检测标准物质三、标准物质在转基因检测中的应用四、国内外转基因植物及其产品检测标准物质五、标准物质的使用六、标准物质管理PCR检测质量保证基本概念：质量保证（qualityassureance，QA）（实验）室内（部）质量控制（internalqualitycontrol，IQC）（实验）室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）准确度（accuracy）偏差（bias）精

2、密度（precision）重复性条件（repeatabilityconditions）批（run）均值（mean）标准差（standarddeviation，SD或s）变异系数（coefficientofvariation，CV）正态分布（gaussiandistribution）室内质量控制与室间质量控制室内质量控制（IQC）：人员批内及批间重复性结果可靠性和有效性；即时评价室间质量控制（EQA）：第三方机构：农业部科技发展中心；农业部系统其他质检机构；质检系统；JRC；GIPSA准确度；不同实验室结果可比性操作与方法；回顾性评价精密度与准

3、确度●●●●●即准确又精确●●●●●准确而不精确●●●●●即不准确又不精确●●●●●精确而不准确均值、标准差与变异系数测定值的分布质量保证：IQC与EQA确定检测目的、内容采样准备采样分样样品运输、保存送样样品接收、编号样品检测检测结果的有效性仪器设备的有效性试剂的质检结果分析判读报告管理决策采样检测报告IQCEQAQA检测前质量控制实验室环境与仪器设备管理实验室环境PCR后PCR（电泳分析）PCR反应体系配制I溶液配制样品接收样品前处理DNA提取纯化PCR反应体系配制II样品保存DNA样品保存仪器设备及材料管理仪器设备维护及校准天平、移液器

4、、定量PCR仪离心管质检：防污染；定量PCR吸头，tips：防污染日常核查：灰尘、细菌，其他实验材料；前次反应产物日常核查要点工作项目核查要点水浴、干浴设备□温度校准及记录生物安全柜□先启动运行30min后再开始工作IQC弱阳性质控□有低中高浓度质控（定量）□有阴性质控：原样品□有经历提取过程空管□有仅含扩增反应混合液管□有实验台面□消毒、清洁□紫外照射加样器、离心机□消毒、清洁实验室各区□单向流动□紫外照射试剂质量核酸提取试剂：尽量简化步骤，降低试剂污染概率PCR扩增试剂—引物、探针：纯度，“错误序列”；特异性—缓冲液、dNTP：KCl/N

5、aCl；Mg2+；dNTP平衡且在20-200μmol/L—Taq酶：比活性20U/pmol试剂贮存：PCR，-20℃；提取试剂，2-8℃试剂质检内外包装性能抗干扰操作程序检测过程涉及多个环节：采样、样品保存、制备、试剂配制、核酸提取、PCR扩增、产物检测、结果分析、报告每一环节都会产生变异过程引起的变异，每一步骤变异总和：主要污染源样品本身实验室其他实验材料上次检测残留物环境主要防污染措施严格分区、单向流动化学清洁：10%次氯酸钠；70%乙醇扩增产物修饰：不能干扰正常扩增检测扩增前修饰：紫外照射，环丁嘧啶二聚体、嘧啶6，4-二聚体等；尿嘧啶

6、-N-糖基化酶（UNG），前次扩增用dUTP代替dTTP，后次反应前UNG处理反应管扩增后修饰：使扩增产物不能作为下次扩增的模板质控数据评价阳性质控样品失控（假阴性）原因：随机误差仪器试剂预防措施：核酸纯化重复与平行的设置样品稀释使用内质控（internalcontrol，IC）假阴性原因分析流程阳性质控样品测定结果偏低或为阴性结果偏低阴性测试样品中无强阳性测试样品中有强阳性离心管含抑制物Taq酶活性低核酸提取效率低核酸提取失败核酸提取抑制物残留核酸提取试剂混入PCR仪孔间温度差异Taq酶失活系统误差随机误差测试样品中有阳性测试样品全为阴性更

7、换离心管更换Taq酶更换提取试剂所有样品重新检测已知DNA同孔扩增更换试剂结果正常结果仍低质控样品及3-5份已知阳性质控样品正常且阳性样品有些值增加质控及已知阳性样品仍异常PCR仪孔温度校准后再检测按系统误差途径分析验证措施阴性质控样品失控原因与预防原因：污染措施：防污染工作项目核查要点实验台面□消毒、清洁□紫外照射加样器、离心机□消毒、清洁实验室各区□单向流动□紫外照射假阳性结果分析流程阴性质控样品测定为阳性同时检测样品的情况测试样品亦全为阳性测试样品中有阳性也有阴性扩增产物污染试剂污染3-5空管室内静止5-8份水样品检测暂停日常检测，实验

8、室清洁、通风试剂直接扩增检测更换试剂扩增产物轻度污染样品间交叉污染5-8份水样品检测有阳性则确认有实验室污染无阳性说明样品间交叉污染改善操作验证验证措施措施室间质量